Librerie di… batteri!

Escherichia coli
Escherichia coli

Il termine libreria, library in inglese, nel caso che andremo ad analizzare si riferisce non ad una vera e propria libreria, ma ad una tecnica scientifica. In particolare sono library quelle raccolte di materiale genomico (pezzetti di DNA) presenti in multiple copie.
Le library sono state e sono ancor oggi molto usate in ambito scientifico, in quanto risultano utili in numerosi esperimenti, dall’imponente progetto di sequenziamento del genoma fino al più modesto di sequenziamento ed espressione, per esempio, di una proteina o di un complesso proteico.
I batteri sono fondamentali in questo passaggio, in quanto, grazie alla peculiarità di contenere di per sé stessi plasmidi (piccole molecole di DNA circolari esterne al genoma in grado di replicarsi, sfruttando ovviamente il macchinario enzimatico cellulare, autonomamente), sono i responsabili dell’amplificazione dei singoli pezzetti di DNA e quindi della creazione finale delle library.
Il motivo per cui vengono usati i batteri è anche il fatto che essi sono estremamente veloci nella duplicazione e più semplici e robusti da manipolare rispetto alle più complicate linee cellulari (umane, ad esempio).

Ma come avviene, a livello pratico, la costruzione di una library?
Innanzitutto è necessario possedere un plasmide, che al giorno d’oggi si può facilmente reperire da un’azienda già completamente costruito Esso, inoltre, è accompagnato da un vero e proprio foglietto di istruzioni che spiegherà come è fatto, quali sono gli elementi che lo compongono (marker di resistenza all’antibiotico ampicillina, per la selezione successiva, un multi-cloning-site, dove sono presenti vari siti di taglio adeguati per diversi enzimi di restrizione, un’origine di replicazione ed altri elementi che possono variare da un plasmide ad un altro) e quali enzimi di restrizione sono in grado di tagliarlo, esempio in foto.
Una volta che si possiede il plasmide è necessario trasformare i batteri, ad esempio Escherichia coli; per fare questo i batteri devono essere innanzitutto resi competenti (ovvero in grado di acquisire il plasmide), solo alcune specie batteriche sono “naturalmente competenti”, cioè possono acquisire DNA a doppia elica estraneo dall’ambiente in modo autonomo; le altre specie vengono rese competenti solo in particolari condizioni fisiologiche (come la fase di crescita esponenziale) e tramite tecniche chimiche (cloruro di calcio) o fisiche (l’elettroporazione), le quali servono a far entrare il plasmide all’interno della cellula, superando la barriera della membrana.

Escherichia coli

A questo punto, dopo aver seminato i batteri su più piastre, si applica una selezione tramite l’antibiotico contenuto nel marker di resistenza, di modo che sopravvivano solo i batteri che hanno integrato il plasmide.
In questo modo si ottengono varie colonie in varie piastre, ognuna con un frammento diverso di DNA: se vogliamo ottenere un certo complesso proteico formato da 4 subunità avremo 4 piastre, ognuna con una delle 4 subunità che ci interessano.
A questo punto i batteri si moltiplicano e, riponendo la piastra o le piastre a 4°C, avremo una fonte (quasi) inesauribile del plasmide con la sequenza della subunità che ci interessa.
Per poter poi ottenere la sequenza desiderata basterà prelevare con un puntale parte dei batteri, coltivarli una notte a 37°C nel medium adatto e quindi applicare un protocollo di trattamenti e centrifugazioni che ci permetterà di isolare i plasmidi dai batteri.

Ecco un’ulteriore dimostrazione di quanto  i batteri possano essere utili, se non indispensabili, nella ricerca!

Laura Tasca

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