Il sistema CRISPR /Cas9: componente dell’immunità adattativa dei batteri

Il termine CRISPR è l’acronimo di Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (brevi ripetizioni palindromiche raggruppate e separate ad intervalli regolari) e si riferisce, dunque, ad un gruppo di brevi sequenze di DNA di origine virale o plasmidica ripetute.

Le sequenze CRISPR sono localizzate nel locus CRISPR sul genoma batterico e, grazie ad esse, il batterio può riconoscere le sequenze derivanti da virus simili a quelli che hanno dato origine alle sequenze CRISPR e prevenire l’infezione da parte di questi.

Quindi, il sistema CRISPR conferisce al batterio una memoria immunologica e, pertanto, viene considerato un componente dell’immunità adattativa procariotica (Mojica et al., 2005).

 

Storia della scoperta del locus CRISPR

Nella ricerca scientifica, una scoperta eccezionale può essere il risultato di un immane lavoro mirato esclusivamente al risultato in questione, oppure può anche capitare che il ricercatore arrivi ad essa mentre la sua ricerca era rivolta a tutt’altro. Nel 1987, Yoshizumi Ishino e i suoi colleghi dell’Università di Osaka, in Giappone, durante il clonaggio della sequenza del gene iap di Escherichia coli (alkaline phosphatase isozyme conversion), a cui era rivolta la loro ricerca, clonarono casualmente anche una regione del locus CRISPR associato a iap. Ebbero, quindi, l’opportunità di osservare brevi sequenze di DNA non usuali, in quanto intervallate da DNA spaziatore anziché essere le ripetizioni contigue identificate sino ad allora.

La straordinarietà della scoperta si diffuse in tutto il mondo e, negli anni ’90, molti gruppi di ricerca europei si dedicarono all’individuazione di nuove sequenze di ripetizioni di DNA. Fu scoperto DNA ripetuto e regolarmente intervallato anche in altri ceppi batterici diversi da Escherichia coli e che queste sequenze erano peculiari per ogni specie batterica.

Nel 1993, il gruppo di ricerca di Francisco Mojica dell’università di Alicante identificò gruppi di ripetizioni di DNA negli Archea e propose la sigla CRISPR per tali ripetizioni di DNA.

Una svolta importante fu la dimostrazione da parte di Ruud Jansen e colleghi dell’Università di Utrecht che il cluster di ripetizioni CRISPR era associato ad un gruppo di geni, che chiamarono cas (CRISPR associated system).

 

Il sistema CRISPR/Cas9

L’identificazione delle proteine Cas associate al sistema CRISPR ha rappresentato un’importante svolta per comprendere la funzione del locus CRISPR.

I sistemi CRISPR/Cas si dividono in due classi, ognuna divisa ulteriormente in tipi e sottotipi distinti in base a caratteristiche strutturali diverse:

  • sistemi di classe 1: locus CRISPR associato a più proteine Cas;
  • sistemi di classe 2: locus CRISPR associato ad una singola proteina Cas.

Importante rilevanza ebbe lo studio del sistema CRISPR/Cas9 identificato in Streptococcus pyogenes.

In particolare, la proteina Cas9 è un enzima endonucleasico associato ad alcune molecole di RNA: crRNA e trascrRNA, reingegnerizzate a formare un unico filamento di single guide RNA (sgRNA). Tale sequenza di sgRNA lega il DNA estraneo complementare ad esso e richiama la proteina Cas9 che induce un taglio al doppio filamento di DNA estraneo.

1. Enzima Cas9 taglia DNA target.

Il DNA tagliato viene acquisito nel genoma batterico e forma le sequenze di DNA spacer nel locus CRISPR del batterio. Il DNA spacer è, in seguito, trascritto in crRNA che viene utilizzato per riconoscere e bloccare una futura invasione di un batteriofago. Il crRNA, dunque, funziona da memoria immunologica per il sistema di immunità adattativa batterico.

Grazie alle possibili modifiche a cui può essere sottoposta la sequenza dell’sgRNA, il sistema CRISPR/Cas9 può riconoscere numerose molecole di DNA target e quindi può essere utilizzato come tecnica di modifica del genoma anche in organismi diversi dai batteri, inclusi Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, Danio rerio, piante, topi, scimmie ed embrioni umani. L’utilizzo del sistema CRISPR/Cas sugli embrioni umani è oggetto di un importante dibattito etico e sociale. Se, da un lato, molti scienziati ritengono sia lecito manipolare la linea germinale per correggere la sequenza mutata di un gene, dall’altro c’è la preoccupazione che agire sulla cellula uovo e sugli spermatozoi umani significhi non riuscire a prevedere quali drammatiche conseguenze queste modifiche possano portare alle generazioni future.

 

  • Immagine in evidenza:  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/4CMQ
  • Immagine 1: https://giuseppebenanti.altervista.org/?p=2078

Fonti:

  • Y Ishino, H Shinagawa e K Makino, Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product., in Journal of Bacteriology, vol. 169, nº 12, December 1987, pp. 5429–5433.
  • F. J. Mojica, C. Díez-Villaseñor e E. Soria, Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria, in Molecular Microbiology, vol. 36, nº 1, April 2000, pp. 244–246.

 

Per approfondimenti sulla questione etica dell’utilizzo di CRISPR/Cas nell’editing genomico:

  • http://bioetica.governo.it/media/172128/p126__2017_l-editing-genetico-e-la-tecnica-crispr-cas9-considerazioni-etiche_it.pdf

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