Come funziona un bioreattore?

La coltivazione di cellule procariotiche ed eucariotiche su scala laboratorio può avvenire in sistemi semplici rappresentati dalle beute o in sistemi più complessi ed accurati rappresentati dai fermentatori o bioreattori.

Le condizioni chimico-fisiche per la crescita delle cellule sono molto variabili e dipendono essenzialmente dal tipo di microrganismo. I parametri di fermentazione da scegliere accuratamente ed eventualmente monitorare lungo l’arco del processo fermentativo sono l’agitazione del brodo di coltura, l’ossigenazione dello stesso (o l’assenza di O2 in caso di processi anaerobici), il pH, la temperatura, e l’eventuale formazione di schiuma.

La beuta (Fig. 1), solitamente posizionata su una pedana rotante all’interno di un incubatore, presenta tutta una serie di limitazioni al monitoraggio e al controllo di alcune di queste variabili come ad esempio il pH, l’ossigenazione o l’anaerobiosi e soprattutto la sterilità poiché si tratta di un sistema aperto e non chiuso ermeticamente.

Figura 1 – Esempio di beute allocate all’interno di un incubatore (per il mantenimento di una temperatura costante) dotato di pedana rotante al fine di garantire una corretta agitazione ed ossigenazione del mezzo di coltura delle cellule.

Per superare queste problematiche è stato messo a punto il bioreattore (Fig. 2), la cui tecnologia è ad oggi in grado di superare la semplice scala di laboratorio ed estendersi anche alla scala industriale (Fig. 3).

Figura 2 – Modello generico di bioreattore su scala laboratorio costituito da una unità di comando per il monitoraggio ed il controllo dei principali parametri di processo, un vessel di vetro in cui avviene la crescita cellulare, una serie di sensori per la misurazione dei parametri chimico-fisici (es. temperatura, pH, ossigenazione, schiuma), pompe peristaltiche per l’iniezione automatica di apposite soluzioni (acide, basiche o nutritive) e bottiglie come riserva delle soluzioni da introdurre nel brodo di coltura.

 

Figura 3 – Fotografia di un impianto di fermentazione su scala industriale costituito da un numero variabile di bioreattori in acciaio collegati da tubazioni per il trasferimento di acqua e gas in uscita ed in entrata.

Si definisce bioreattore un dispositivo in grado di fornire un ambiente adeguato alla crescita di microrganismi. Esso è in grado di assicurare una condizione di sterilità e fornire alle cellule tutto ciò di cui necessitano, permettendo allo stesso tempo di monitorare in maniera semplice e veloce tutti i parametri di crescita.

Uno dei parametri più importanti è la temperatura, la quale durante la crescita cellulare tende ad aumentare a causa delle reazioni esotermiche collegate al metabolismo microbico. Un suo incremento eccessivo causerebbe un rallentamento della crescita cellulare o in casi estremi la morte della coltura. Per questo motivo un termometro collegato all’unità di comando è immerso nel brodo di coltura per monitorare costantemente il suo valore. L’isotermia è garantita da una camicia posta a rivestimento del vessel di vetro in cui scorre dell’acqua a temperatura controllata.

L’agitazione è garantita da una serie di pale rotanti collegate ad un motore (solitamente posto in testa al bioreattore). La forma, la dimensione, la distanza e la velocità di rotazione delle pale può essere modificata a seconda delle esigenze. Le pale sono fondamentali non solo per miscelare le cellule e i nutrienti (che vengono forniti sterilizzati e filtrati mediante una pompa in entrata) ma anche per disciogliere al meglio l’ossigeno che viene fornito dal basso sotto forma di bolle. Inoltre, un elemento fondamentale all’interno del vessel di vetro è rappresentato dai frangi-flussi, la cui funzione è appunto quella di rompere flussi rotativi fissi che creerebbero delle zone non omogenee all’interno del mezzo di coltura. Nel caso in cui l’organismo coltivato sia un anaerobio stretto, ovvero non sopravviva in presenza di ossigeno, viene semplicemente insufflato azoto nel mezzo di coltura piuttosto che aria.

In caso di coltura di cellule molto sensibili agli stress meccanici dovuti alle pale, come ad esempio i funghi filamentosi, l’agitazione è garantita mediante l’insufflazione di un potente getto d’aria compressa sterile. Bioreattori dotati di questa tipologia di agitazione prendono il nome di air-lift.

I principali parametri sono monitorati mediante sensori di pH, temperatura, ossigeno e schiuma collegati all’unità di comando che, qualora il valore registrato si discosta dal valore di set-point impostato dall’operatore, innesca una risposta appropriata per riportare le condizioni alterate a quelle desiderate ed ottimali per la crescita cellulare. Ad esempio, se con l’aumento della biomassa cellulare dovesse verificarsi un aumento della CO2 prodotta e quindi una diminuzione del pH, a causa della sua solubilizzazione nel mezzo di coltura con formazione di acido carbonico, l’unità di comando attiverebbe la pompa collegata alla riserva di soluzione basica concentrata per introdurre nel sistema un piccolo volume di soluzione tale da riportare il pH al valore ottimale impostato. Un meccanismo analogo si attiva in caso di aumento del pH con l’introduzione di una soluzione acida.

Analogamente, in caso di formazione di schiuma, dovuta all’agitazione, una apposita sonda, posta ad una altezza desiderata, ne rileva la presenza ed attiva la pompa collegata alla riserva di anti-schiuma.

Infine, tramite una valvola in uscita è possibile raccogliere in modo sterile un campione del mezzo di coltura su cui effettuare separatamente una serie di analisi per misurare la concentrazione cellulare, i nutrienti ancora presenti nel mezzo di coltura ed i prodotti di fermentazione.

Infine, alcuni bioreattori sono dotati di sensori di gas per la quantificazione della CO2 o dell’H2 (nel caso di microrganismi metanogeni).

La figura 4 riporta un classico schema di impianto di un bioreattore.

Figura 4 – Rappresentazione schematica della struttura di un fermentatore.

In generale, esistono bioreattori di diverse dimensioni, da quelli di 1L di volume, utilizzati sui banconi dei laboratori di ricerca, fino a quelli da 1 milione di litri, usati per le grandi produzioni industriali. Il passaggio della produzione da un bioreattore più piccolo a uno più grande viene chiamato scale-up.

I metodi di coltura delle cellule in un bioreattore sono essenzialmente cinque, classificabili sulla base del metodo di somministrazione del terreno di coltura.

1) Colture in batch (a sistema chiuso), in cui il volume di terreno liquido nel quale le cellule crescono è essenzialmente costante. Le cellule, crescendo, aumentano la loro biomassa, riducono la quantità di nutrienti disponibile, producono metaboliti da eliminare. Le cellule raggiungono così un livello (detto stato stazionario) tale da impedire di aumentare ulteriormente il loro numero.

2) Colture in fed-batch (sistema chiuso alimentato), in cui è possibile prolungare il tempo di crescita delle cellule prima di raggiungere lo stato stazionario. Il terreno viene infatti continuamente addizionato alla coltura.

3) Colture in perfusione in cui oltre all’aggiunta di terreno fresco, viene anche prelevato il terreno usato (privo di cellule) ed i metaboliti escreti. È un metodo ampiamente usato nelle colture di cellule animali.

4) Colture continue in cui ad una coltura in batch in fase di crescita esponenziale si addiziona una certa quantità di terreno fresco e se ne sottrae una equivalente di terreno usato con cellule. In questo modo, restando costante la biomassa, si ottiene una crescita pressoché bilanciata: anche le concentrazioni di sostanze nutrienti e di metaboliti, infatti, restano essenzialmente costanti.

5) Colture su strato solido che si svolgono in assenza di acqua allo stato libero (in alcuni casi l’acqua è presente in quantità ridotte). Tra i substrati solidi più utilizzati figurano legumi, cereali, ed altri materiali di origine vegetale come paglia o segatura.

In conclusione, la gestione dei processi di biotrasformazione microbiologica non risulta troppo dissimile dalla gestione di un processo di sintesi o comunque di trasformazione chimica. La conduzione di un fermentatore, sia esso in scala pilota oppure di grandi dimensioni utilizzato per finalità produttive, presenta diverse analogie con la conduzione di un reattore dove uno o più reagenti, in determinate condizioni ambientali (es. temperatura, pressione, pH) ed eventualmente in presenza di catalizzatori sono trasformate in uno o più prodotti, magari con la co-generazione più o meno controllabile di sottoprodotti indesiderati.

 Nicola Di Fidio

 

Sitografia

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Nicola Di Fidio, Ph.D. student
Department of Chemistry and Industrial Chemistry – University of Pisa
Via G. Moruzzi 13 – 56124 Pisa
MSc. in Industrial and Environmental Biotechnologies
Mob: +39 3299740251
Primary e-mail: nicola.difidio91@gmail.com
Secondary e-mail: n.difidio@studenti.unipi.it

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