Identificazione dei microrganismi che compongono la flora batterica della vescica

Un gruppo di ricercatori della Stritch School of Medicine ha reso coltivabili le specie batteriche che costituiscono la flora batterica urinaria modificando il protocollo standard di coltura e ha identificato le specie batteriche residenti nelle urine mediante sequenziamento del gene rRNA 16S. 

Una ricerca di appena quattro anni fa ha demolito l’idea che l’urina fosse sterile. Evann E. Hilt e altri studiosi dell’Istituto di malattie infettive ed immunologia della Loyola University Chicago Stritch School of Medicine (SSOM) hanno sviluppato un protocollo per identificare i batteri residenti nella vescica di femmina adulta.

Secondo i ricercatori, i protocolli di urinocoltura classici hanno permesso il consolidarsi della convinzione riguardante la sterilità delle urine soprattutto per due probabili motivi: il numero dei microrganismi da ricercare è inferiore alla soglia di coltura oppure la crescita batterica richiede condizioni di coltura specifiche – anaerobiosi, incubazione prolungata –  non utilizzate nei protocolli standard di coltura delle urine.

Il sequenziamento del gene codificante l’rRNA 16S è utilizzato per la caratterizzazione del genoma batterico delle specie colonizzanti le urine. Il protocollo modificato utilizzato dai ricercatori della SSOM richiede maggiori volumi di urina ed è indicato con la sigla EQUC (Expanded Quantitative Urine Culture, urinocoltura quantitativa ampliata).

Dunque, l’alterazione delle condizioni di coltivazione utilizzate nel protocollo EQUC ha permesso la coltivazione delle specie microbiche presenti nelle urine identificate precedentemente per mezzo del sequenziamento del gene rRNA 16S, altrimenti non coltivabili.

Per questo studio, il gruppo di ricerca della SSOM ha utilizzato campioni di urine di sessantacinque donne comprendenti quarantuno pazienti affette da vescica iperattiva (disturbo caratterizzato da frequente minzione e da incontinenza urinaria) e ventiquattro donne fungenti da controllo, quindi immuni da qualsiasi disturbo vescicale.

Protocollo standard e protocollo EQUC

I campioni di urina recuperati sono stati trattati mediante protocollo standard e mediante protocollo EQUC. Nel protocollo standard, la quantità di 0,001 mL di urina è stata inoculata su un terreno di agar – sangue di pecora (blood agar plate, BAP) e su un terreno selettivo di agar MacConkey ed è stata successivamente strisciata. Le piastre sono state incubate in condizioni di aerobiosi a 35°C per 24h. Ogni colonia è stata contata senza trascurare il livello di rilevamento di 103 CFU (Colony Forming Unit, unità formante colonia). Si è proceduto alla identificazione delle dei batteri costituenti la colonia cresciuta. Nel protocollo EQUC, l’incubazione, aumentata di 24h,  è stata effettuata in condizioni di anaerobiosi. Successivamente, si è effettuata una ulteriore incubazione su terreno BAP in presenza di atmosfera a 35°C e 30°c per 48h. Hanno seguito ulteriori incubazioni in anaerobiosi e in miscela di gas. Il livello di rilevamento del protocollo EQUC è del valore di 10CFU/mL. Per identificare eventuali colonie batteriche con quantità inferiore al livello di rilevamento, 1,0 mL di urina è stato incubato in tioglicolato in condizioni aerobiche a 35°C in cinque giorni.

In seguito all’isolamento del DNA e all’amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction), è stato sequenziato il gene rRNA 16S dei batteri formanti le colonie cresciute.

Mediante l’utilizzo di entrambi i protocolli, standard e EQUC, sono stati rilevati numerosi batteri appartenenti ai generi Lactobacillus, Corynebacterium, Streptococcus, Actinomyces e Staphylococcus. Per ogni genere rilevato sono stati identificate le seguenti specie: Lactobacillus gasseri, Corynebacterium coyleae, Streptococcus anginosus, Actinomyces neuii, e Staphylococcus epidermidis.

Maria Chiara Langella

 

Immagine in evidenza: http://www.analisicata.com

Fonte: Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Evann E. Hilt, Kathleen McKinley, Meghan M. Pearce, Amy B. Rosenfeld, Michael J. Zilliox, Elizabeth R. Mueller, Linda Brubaker, Xiaowu Gai, Alan J. Wolfe, and Paul C. Schreckenberger. 2014. Journal of Clinical Microbiology. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3957746/

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