CRISPR-Cas9 è meno sicura di quanto pensato? Non fraintendiamo…

Dalla sua scoperta nel 2007 come meccanismo di difesa batterico contro le infezioni virali ad oggi, CRISPR-Cas9 è una tecnica che ha spopolato sia nei laboratori di ricerca sia nella cultura di massa. Se nei primi viene ormai utilizzata come metodo d’elezione per esperimenti di mutagenesi, dall’altra parte, diversi siti le hanno dedicato approfondimenti appositi (Le Scienze, Blog CRISPR, CRISPR su Twitter, ScienceDaily, ecc.

La sicurezza di questo metodo di ingegneria genetica è stata da subito messa alla prova per valutarne le possibili applicazioni, con risultati rassicuranti. Negli anni sono stati messi a punto diversi accorgimenti per migliorarne la precisione e diminuire le mutazioni nella regione target. Spesso però, come sottolineano gli autori di uno studio pubblicato il 16 luglio 2018 su Nature Biotechnology, per valutare le lesioni indotte da CRISPR-Cas9, vengono utilizzate linee cellulari tumorali. Queste cellule hanno meccanismi di riparazione del DNA anomali e non sempre sovrapponibili a quelli di cellule sane. L’analisi genomica svolta dai ricercatori (non solo quindi in prossimità del sito target), ha mostrato che la frequenza di alterazioni sul DNA è più elevata di quanto si fosse appurato, anche nel caso di editing preciso da parte di Cas9 (ovvero senza off-target).

Per arrivare a questa conclusione gli autori hanno inizialmente preso in esame cellule staminali embrionali maschili di topo (ES). Tramite un vettore è stato possibile inserire in queste cellule la proteina Cas9 con vari sgRNA’s (RNA guida) diretti verso il locus PigA (emizigote perché presente nel cromosoma X). Selezionando poi i cloni cellulari che esprimevano sia la Cas9 sia un sgRNA, è stata valutata l’efficienza di delezione del locus PigA, al variare del sgRNA inserito. Per distinguere i cloni con PigA rimosso, è stato utilizzato il FACS (qui spiego il suo funzionamento). Per valutare gli effetti a livello genomico delle modificazioni introdotte, sono state amplificate diverse regioni attorno al locus stesso.

Ripetendo l’esperimento anche in altre linee cellulari, è stato possibile confermare che le alterazioni genomiche sono presenti anche nel caso di un editing mirato. Spesso però esse non sono rilevabili con le analisi di routine normalmente utilizzate per la validazione dell’editing. Queste alterazioni possono comprendere inversioni, traslocazioni e delezioni, con effetti genomici anche ad ampio raggio.

E’ la prima volta che si scoprono effetti indesiderati di CRISPR?

Non fraintendiamo…in realtà non è la prima volta che si scoprono effetti indesiderati legati all’utilizzo di questa tecnica. Risultati che pongono dei freni all’utilizzo terapeutico di questa tecnologia erano già emersi in altri lavori (ad esempio qui: https://phys.org/news/2017-05-crispr-gene-hundreds-unintended-mutations.html). Ora, questo studio sistematico sui possibili effetti indesiderati potrà contribuire a valutare meglio gli esiti dei trattamenti eventualmente immaginabili con CRISPR-Cas9. Certo, questo studio suggerisce inoltre la necessità di verificare in maniera sempre più accurata gli esperimenti di editing genetico. Come spesso accade infatti per le grandi scoperte, c’è bisogno di tempo per comprenderle nel dettaglio, prima che esse diventino pienamente spendibili. Imprecisioni ci sono sempre, ma è proprio per questo che si cerca di migliorarle…le vicende di CRISPR quindi di sicuro non si fermeranno qui.

In che direzione va CRISPR-Cas9?

Soltanto pochi giorni fa, una sentenza della Corte Europea, ha stabilito che le piante modificate con CRISPR sono da considerarsi a tutti gli effetti degli OGM. Una notizia tutt’altro che positiva per il mercato biotech, in quanto impone a tutti gli organismi modificati con questa nuova tecnologia di editing genomico una lunga e stringente regolamentazione, tipica appunto degli OGM. Sicuramente questa decisione farà quindi discutere; ma tra scoperte euforiche, qualche battuta d’arresto e qualche parere negativo da parte di organizzazioni legislative…in che direzione sta andando CRISPR-Cas9?

Chi può dirlo. Certo è che le ricerche su di essa vanno talmente veloci che ad oggi vengono pubblicati più di 3 articoli al giorno su questo argomento. E si pubblica davvero di tutto, potete stare certi quindi che non si smetterà di parlare di lei. Giusto l’anno scorso ad esempio, in un laboratorio a Kanazawa (Giappone), alcuni ricercatori sono riusciti addirittura a “filmare” CRISPR-Cas9 dal vivo, con l’ausilio di un microscopio a forza atomica. Il video lo potete trovare qui, …ma non aspettatevi una risoluzione 4k eh ;).

 

Roberto Amadio

 

Bibliografia e approfondimenti

https://www.nature.com/articles/nbt.4192.pdf

http://www.lescienze.it/news/2018/07/17/news/editing_genetico_crispr_cas9_alterazioni_delezioni_inaspettate_sicurezza-4048377/

https://www.youtube.com/watch?v=4YKFw2KZA5o

Credits foto

https://michelsonmedical.org/2015/09/16/crispr-cas9-art-genome-editing/

https://www.ecosia.org/images?q=crispr+meme#id=56671C3B6F33E4D5633579AAF1E58DF194513FDF

Laureato in biologia, specializzando in Genomica Funzionale presso l’università di Trieste. Musicista (strimpellatore), animatore per bambini e ragazzi (ci provo), curioso e appassionato di divulgazione scientifica. Umorismo anomalo (dicono), adoro le escursioni in montagna e i tramonti sul mare.

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Laureato in biologia, specializzando in Genomica Funzionale presso l'università di Trieste. Musicista (strimpellatore), animatore per bambini e ragazzi (ci provo), curioso e appassionato di divulgazione scientifica. Umorismo anomalo (dicono), adoro le escursioni in montagna e i tramonti sul mare.

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