Guida pratica all’utilizzo del FACS

L’acronimo FACS (sì, non ha niente a che vedere col FAX) sta per Fluorescence Activated Cell Sorter ed è un apparecchio utilizzato in diversi laboratori di ricerca e diagnostica per fare analisi su popolazioni cellulari. L’idea di base del FACS è quella di allineare le cellule (o le particelle da analizzare) in fila indiana lungo un flusso laminare. Illuminarle quindi una ad una; rilevare il segnale con un sistema ottico; analizzare i dati acquisiti al computer con specifici software ed infine suddividere le popolazioni cellulari in base ai parametri scelti per l’analisi.

La chiave per la buona riuscita di un esperimento al FACS è proprio il primo passaggio, ovvero la generazione di un flusso che permetta alle cellule di passare in fila ordinata davanti alla sorgente di eccitazione-rilevazione. Per ottenere tale risultato, viene applicata una corrente esterna al flusso su cui scorre il campione biologico più intensa, così da idrofocalizzare il flusso interno stesso (figura 1).

Figura 1 – Idrofocalizzazione del flusso in maniera da rendere il passaggio delle cellule in fila indiana.

Una volta che le cellule passano il fascio di luce (generato da lampade ad arco o laser), si possono avere due fenomeni distinti: light scattering, ovvero deviazione del fascio di luce in base alle caratteristiche fisiche della particella o fluorescenza, nel caso in cui siano state coniugati fluorofori ai fini dell’esperimento.

Per quanto riguarda il light scattering, vengono raccolti due parametri informativi sulla caratteristica della cellula che sta passando: forward scatter e side scatter. Nel primo caso si va a vedere la deviazione del raggio luminoso da 0 a 20 gradi di angolazione: questo parametro fornisce informazioni sulla grandezza della particella analizzata. Nel secondo caso viene valutata invece la deviazione della luce a 90 gradi, così da determinare la granulosità, rugosità o il rapporto nucleo/citoplasma, tutte caratteristiche che deviano abbondantemente il fascio luminoso.

Il grafico che si può ricavare da questa semplice analisi è un citogramma monodimensionale o un dot-plot bidimensionale (figura 2), dove ogni puntino rappresenta una singola cellula rilevata e analizzata.

Figura 2 – Esempi di diversi esperimenti con visualizzazione di citogramma monodimensionale, dove sull’asse y c’è la frequenza e sull’asse x il parametro valutato (in alto). Oppure di dot-plot bidimensionale, dove i due assi del grafico indicano 2 parametri fisici o di fluorescenza (in basso).

Utilizzando dei marcatori fluorescenti specifici per degli antigeni è possibile discriminare popolazioni cellulari in base a parametri biochimici invece che fisici. Un esempio di dot-plot ottenuto in base alla combinazione di un parametro fisico con una fluorescenza è riportato in figura 3.

Figura 3 – Analisi di un campione ematico di globuli bianchi, combinando un parametro di fluorescenza con uno fisico.

Come ultimo passaggio per effettuare un FACS completo, rimane il sorting, ovvero la separazione fisica di una determinata popolazione cellulare di interesse. Questo può venire effettuato istruendo lo strumento ad applicare una carica elettrica alle sole goccioline che contengono cellule risultate positive all’analisi effettuata, in modo tale da separarle dal resto tramite apposite piastre cariche (figura 4).

Figura 4 – Separazione fisica delle goccioline contenenti diverse popolazioni cellulari.

Tra le varie applicazioni del FACS si possono ricordare tra gli altri: saggi di identificazione di marker specifici, saggi di apoptosi, analisi di vitalità cellulare, studi di risposta a farmaci in vitro, analisi di espressione e localizzazione proteica, separazione cellulare.

 

Roberto Amadio

 

Bibliografia e approfondimenti

  • Animazione didattica di introduzione al FACS guarda qui
  • http://users.unimi.it/dmora/materiali/BM2012/PrincipiCFM.pdf
  • https://it.wikipedia.org/wiki/Citometria_a_flusso

Credits foto

  • Tag cloud generata con wordclouds
  • https://bio-ggs.blogspot.com/2010/05/ggs-live-flow-cytometry.html
  • https://www.ecosia.org/images?q=citofluorimetro+#id=F2623B53B03FAA5D3D37E198A8F997AB241D3BA2
  • http://www.keywordsking.com/Zmx1b3Jlc2NlbmNlIGFjdGl2YXRlZCBjZWxsIHNvcnRlcg/

Laureato in biologia, specializzando in Genomica Funzionale presso l’università di Trieste. Musicista (strimpellatore), animatore per bambini e ragazzi (ci provo), curioso e appassionato di divulgazione scientifica. Umorismo anomalo (dicono), adoro le escursioni nella natura e i tramonti sul mare.

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Laureato in biologia, specializzando in Genomica Funzionale presso l'università di Trieste. Musicista (strimpellatore), animatore per bambini e ragazzi (ci provo), curioso e appassionato di divulgazione scientifica. Umorismo anomalo (dicono), adoro le escursioni nella natura e i tramonti sul mare.

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