Candidatus Liberibacter solanacearum, su carote

Ancora Candidatus Liberibacter, come nel recente studio sull’inverdimento degli agrumi, approfondito pochi giorni fa. Ma qui, si tratta di Candidatus Liberibacter solanacearum (CLso), un batterio che attacca ed infetta elettivamente alcuni tipi di vegetali. Tra questi le carote: dolci, consolatori ortaggi, di mille ipocalorici spezzafame. Ne deturpa l’aspetto e ne travolge l’assetto molecolare. Ma i vegetali, si sa, non mollano.

Carote: antichi ortaggi delle meraviglie

Per la sistematica vegetale sono esemplari di Daucus carota L., perchè l’aristotelico Teofrasto, filosofo e botanico (371 a.C. – 287 a.C.), impose loro nome δαῦκον, a cui si uniformò anche Dioscoride, pilastro della fitofarmacologia del I secolo d.C., “il buon raccoglitor” del limbo dantesco (Inf. IV, 139-140). Il verbo δαίω, bruciare, riscaldare, ne apre il senso: sì, la carota era ritenuta una pianta dall’effetto vagamente riscaldante per il corpo. Parliamo degli albori della farmacopea naturale. Il termine carota, invece, si deve al tardo latino, ed ancora al greco καρωτόν, dall’indoeuropeo, con il significato di “corno”, per l’ovvia forma della radice.

Dall’Eurasia meridionale, oggi, le carote giungono a crescere nelle zone temperate di tutto il mondo. Ben note ad Ippocrate, e poi a Plinio, come vegetali acri, sottili, nodosi, a polpa bianca e dura come pietra. Per i teneri bastoncini arancioni da cocktail, si dovrà, infatti, attendere la selezione agronomica, iniziata nel XVI secolo.

Per suggestionarci ancora, sia noto che, secondo antiche credenze popolari, un’infiorescenza di carota, raccolta nelle notti di luna piena, fosse capace di sconfiggere l’epilessia, ma anche di favorire il concepimento, se posta in decozione nel vino. Proprietà immancabilmente afrodisiache, per l’uomo, sono ascrivibili al radicato simbolismo medievale, che di forme e colori degli elementi naturali, faceva istruzioni d’uso medico.

“La biondella che ha gambo quadrangolare, guarisce dalla febbre quartana. […] Le pietre gialle o verdi guariscono itterizia e le malattie del fegato; quelle rosse, le emorragie e i flussi di sangue.”

Jacque Le Goff

LA CIVILTÀ DELL’OCCIDENTE MEDIEVALE

Solanacearum, psillidi e carote

I guai biochimici, per le carote, giungono trasportati da esemplari di Trioza apicalis, psillidi che, mentre si nutrono delle foglie, inoculano il patogeno Candidatus Liberibacter solanacearum (CLso). Essendo il batterio patogeno responsabile di molte altre fitopatie, in giro per il mondo, ormai se ne contano 10 aplotipi.

Gli aplotipi A, B ed F sono forieri di Zebra Chip nelle patate, in America; in Europa, invece, gli aplotipi C, D ed E causano patologie in colture apiaceae, tra cui sedano e carote. Dal latino apium, sedano, le Apiaceae sono piante erbacee annuali, biennali o perenni. Dal 1672 il sistematico Robert Morison le ha definite anche Umbrellifere (figura 1), per l’infiorescenza ad ombrella. Lo sono carote, sedano, prezzemolo, finocchio, aneto, centifolia, coriandolo, cumino, pastinaca, achillea. E la cicuta di Socrate (figura 2).

Segni e sintomi, nelle carote infette da CLso aplotipo C, si intrecciano con quelli procurati dagli psillidi vettori T. apicalis: accartocciamento fogliare, crescita stentata del germoglio, come dell’apparato radicale; l’infezione batterica, in particolare, provoca scolorimento delle foglie. Ma mentre i segni parassitari sono immediatamente rilevabili, quelli patogenetici hanno una manifestazione più tarda, dopo 45 giorni circa dall’inoculo batterico, se il titolo del patogeno è elevato.

La trascrittomica può svelare le interazioni tra CLso e carote: lo studio

La prima sequenza genica di specie batteriche non coltivabili, di Candidatus Liberibacter, si ottenne da CLas, responsabile dell’inverdimento degli agrumi. Mentre, il primo studio di trascrittomica su CLso ha avuto corso su patate, rivelando anche profili d’espressione genica differenti tra varietà diverse di Solanaceae, ma non tra differenti parti vegetali degli ortaggi colpiti. Studi recenti hanno inoltre messo in luce che i vettori, Bactericera cockerelli o Diaphorina citri, che ospitino o meno CLas o CLso, stimolano risposte diverse negli ospiti vegetali. Evidentemente Candidatus Liberibacter modula la capacità di reazione delle piante agli psillidi.

Certo, anche a detta degli stessi ricercatori dell’ultimo studio su CLso, il profiling trascrizionale dell’intero genoma di un patogeno strettamente floematico non è tecnicamente agevole da conseguire, poichè l’mRNA batterico è, chiaramente, una frazione minoritaria dell’mRNA totale. Soprattutto nelle fasi iniziali dell’infezione, quando il titolo batterico è ancora basso.

Prima d’ora, non si era mai realizzata alcuna analisi di trascrizione su CLso, aplotipo C, D o E, e su piante Apiaceae infette.

Cronache sperimentali

I ricercatori, guidati da Jinhui Wang, hanno ottenuto sequenze geniche di alta qualità, da carote coltivate, ed una bozza di sequenza di alta qualità del CLso aplotipo C. Da questo momento, quindi, è stato possibile condurre analisi trascrittomica duplice sull’aplotipo C batterico e sulla carota, ospite vegetale.

Scopi del lavoro sono:

• valutazione dei cambiamenti d’espressione genica delle carote, alla comparsa dei segni d’infezione;
• monitoraggio dell’espressione genica dell’aplotipo C batterico, nell’ortaggio, durante differenti fasi dell’infezione.

A tal fine, piante di carote hanno subìto attacco programmato di psillidi, recanti il CLso; mentre altre restavano prive di inoculo. I ricercatori hanno analizzato i campioni dopo 4, 5 e 9 settimane da tale trattamento infettivo. Mediante duplice sequenziamento di RNA (batterio ed ospite).

Dal momento che non tutti gli psillidi reclutati ospitavano il batterio Candidatus Liberibacter solanacearum, aplotipo C, per incrementare le possibilità d’infezione, i ricercatori hanno applicato 2 psillidi su ogni pianta, rimuovendoli però dopo tre giorni, per evitare danni eccessivi. Tre settimane dopo, i ricercatori hanno prelevato da ogni pianta la terza foglia, per determinare lo stato d’infezione da CLso in corso mediante PCR real-time.

Tragitto infettivo del Candidatus: prime deduzioni

Poichè la terza foglia di ogni pianta di carota si è sviluppata dopo rimozione degli psillidi, i batteri avranno raggiunto tale nuovo getto vitale, previa disseminazione, dalla foglia di inoculo verso la radice, e da questa alla nuova foglia. Nell’arco di 3 settimane l’infezione quindi è già sistemica.

I ricercatori hanno, dunque, raccolto campioni per l’analisi di sequenziamento dell’RNA, dopo 4 e 9 settimane, nel primo esperimento; dopo 5 e 9 settimane nel secondo. Tre piante infettate, scelte come campioni, hanno sostenuto il confronto con tre piante di carote sane, prive di inoculo (controlli).

Nei piccioli delle piante infette, titoli relativi di CLso sono risultati 7.6 x 10^2 volte più alti, in media, dei campioni a 9 settimane dall’inoculo, rispetto ai corrispondenti di 4 e 5 settimane. Il che riflette naturalmente l’avvenuta crescita batterica. Nel primo esperimento, i titoli di CLso sono sensibilmente più alti nelle radici che nei piccioli, a 4 settimane dall’inoculo; mentre a 9 settimane i valori si equiparano. Nel secondo esperimento, le piante infette hanno restituito titoli di CLso nei piccioli significativamente alti rispetto alle radici, sia a 5 che a 9 settimane. Tale diversa distribuzione topografica e temporale, dei batteri nelle carote, rende ragione della disseminazione nel floema degli invasori, dopo la colonizzazione radicale. E, con quel fluido vitale, portando disordine nelle nuove foglie.

Fenotipicità dell’infezione da CLso, nelle carote

Esposte a titolo relativo batterico di 10^5, le carote manifestano riduzione del peso di radice, ed incremento di quello fogliare. Le piante infette, sicchè, hanno un rapporto di peso radicale su peso fogliare inferiore, rispetto alle piante esposte ad azione di psillidi con bassa o nessuna concentrazione di batteri Candidatus Liberibacter solanacearum. E questo dato riafferma la responsabilità del batterio sul peso di radice.

Dopo 9 settimane dall’avvio d’infezione, indotto mediante psillidi, compaiono sulle carote le prime discromie. Tuttavia, al TEM, i batteri CLso si rintracciano solo nelle cellule del setaccio floematiche, ed in nessun’altra cellula dell’ortaggio. Bloccati, anche, i plasmodesmi, da materiale calloso, tra una cellula del setaccio e l’altra. Tali cellule, inoltre, da infette, sembrano contenere materiale denso e fibroso. Probabilmente Proteine P aggregate: quelle che secondo Jekat e colleghi, sigillerebbero danni sui vasi di Arabidopsis thaliana.

Sempre dopo 9 settimane dall’inoculo batterico, nei tessuti vascolari delle foglie di carote infette, risultano più numerose del normale le cellule del setaccio molecolare: recentemente qualificato come segno di resistenza vegetale all’infezione. Forma di rigenerazione floematica, peraltro, riscontrata anche nei frutti di agrumi aggrediti da CLas.

Risposte genetiche all’infezione da CLso

In tutti i sets sperimentali, 99 DEGs di carota sono sempre presenti, quindi risultano coinvolti nella risposta all’infezione da CLso, sia in stadi patologici iniziali, che avanzati. I geni che risultano particolarmente stimolati dallo stato d’assedio, sono quelli codificanti per proteine At5g66910, di resistenza alla patologia. I geni maggiormente soppressi, invece, dalla presenza del patogeno CLso, sono quelli correlati a fattori di trascrizione, come HY5. Ma anche i geni dei cloroplasti risultano espressi differentemente in piante infette, ai diversi tempi sperimentali: 8 down-regolati, 2 up-regolati.

Con l’ausilio della GO pathway analysis e del KEGG database, è emerso che grandemente indotte, dall’infestazione di psillidi e dall’infezione batterica, sono le vie di sintesi e secrezione proteica, quella dei fenilpropanoidi, biosintesi lipidica e del proteosoma; regolazione ormonale ed interazioni pianta-patogeno, invece, sono presenti solo in alcuni campioni. Particolarmente soppresse, di contro, trascrizione genica, replicazione, metabolismi secondari, fotosintesi.

Le piante, anche le più piccole, non si arrendono mai

A 9 settimane dall’inoculo di CLso, anche l’enzima GAD1 risulta stimolato dall’infezione. Esso è responsabile della sintesi del famoso neurotrasmettitore GABA, che oltre alle classiche funzioni inibitorie sul nostro sistema nervoso centrale, ha anche funzione di segnale, nel regno vegetale, di resistenza allo stress ed ai patogeni, nel ricircolo nutritivo, nella biosintesi delle componenti della parete cellulare.

Alterare l’accessibilità delle vie di trasporto dei nutrienti, la disponibilità degli stessi, il profilo ormonale e lipidico, nell’insieme, stimola il catabolismo delle piante. Queste, tuttavia, resistono e resistono, intaccando le scorte, per fornire energie supplementari ai sistemi di difesa, impegnati e messi alla prova da un assalto complesso e coordinato di patogenicità.

Sicchè, i cambiamenti cromatici e fenotipici rendono solo manifesta la migrazione degli agenti biochimici attivi dalle sedi di deposito a quelle di lotta, sulla linea del fronte.

Fonti

• https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/MPMI-10-20-0274-R
• Immagine d’anteprima fonte: https://www.thelittlebigstore.com.au/product/carrot/
• Figura 1 fonte https://www.ponzaracconta.it/2011/07/07/passioni-botaniche-ponzesi-7-carote/
• https://www.microbiologiaitalia.it/batteriologia/clas-inverdimento-degli-agrumi-ed-antidoti-batterici/
• https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/20153035287
• https://apsjournals.apsnet.org/doi/full/10.1094/PDIS-11-16-1686-RE
• https://link.springer.com/article/10.1007/s10658-019-01890-0
• https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.00277/full