Vibrio cholerae

Caratteristiche

Vibrio cholerae è uno dei batteri clinicamente più rilevanti e studiati, in quanto agente eziologico del colera. Afferente all’eterogeneo gruppo dei vibrioni (il termine “vibrione” è comunemente utilizzato per indicare un microrganismo del genere Vibrio) trattasi di un bacillo corto: circa 0,5 μm di larghezza e 2 μm di lunghezza.

Gram-negativo, il batterio mostra una singolare morfologia a bastoncello arcuato (Figura 1). La tipica conformazione a virgola è dovuta ad una curvatura dell’asse maggiore della cellula batterica, che per questo assume la forma della lettera “C”.

V. cholerae è dotato di motilità grazie alla presenza di un flagello unico, posto ad una estremità della cellula che ne consente il movimento. Trattasi, inoltre, di un batterio:

Generalmente privo di capsula e non invasivo;
Aerobio-anaerobio facoltativo;
Asporigeno;
Adattabile a vari fattori ambientali.

I batteri del genere Vibrio colonizzano con facilità diverse tipologie di habitat, non avendo particolari richieste nutrizionali. Nello specifico V. cholerae predilige ambienti acquatici: in acqua sopravvive dai 7 ai 13 giorni, nel latte fino a 14 giorni. Una volta contaminati, le acque e gli alimenti fungono da vettori su piccola scala per questa specie, che infetta prevalentemente l’apparato intestinale dell’uomo. Più rara è una trasmissione mediante contatto diretto.

Nell’ospite il batterio non diffonde oltre la mucosa intestinale ma rilascia una tossina termolabile, la tossina colerica, causando tossinfezioni gravi. Tuttavia è bene sottolineare che non tutti i ceppi di V. cholerae sono patogeni.

v. cholerae al SEM — *Figura 1 –* V. cholerae al SEM. Il microscopio elettronico a scansione consente di mettere in evidenza il flagello polare dei vibrioni nonché il loro profilo unico

Tipizzazione

In base agli antigeni cellulari si distinguono oltre 200 sierotipi. Tra questi solo due, identificati dall’antigene di superficie O ,O1 e O139, sono classificati come vibrioni del colera, tendenzialmente a carattere epidemico/pandemico. Pochissimi altri sono tossigenici e solo un piccolo gruppo è responsabile di gastroenteriti lievi. I restanti non sono da considerarsi pericolosi per la salute umana.

V. cholerae O1

Vibrio cholerae O1 comprende due biotipi, che si differenziano a livello genetico e biochimico: biotipo classico ed El Tor. Entrambi a patogenicità esclusivamente o prevalentemente intestinale, si trasmettono per via oro-fecale. Il ceppo El Tor è l’unico con attività emolitica: la citolisina solubile prodotta (emolisina) degrada selettivamente la membrana dei globuli rossi.

Tra i due ceppi El Tor è quello più virulento e con una più alta infettività ma necessita comunque, come tutti i vibrioni, di una carica microbica elevata per causare l’infezione. Presenta, rispetto al biotipo classico, un maggior adattamento ambientale. Questa prerogativa consente al batterio di sopravvivere più a lungo nei bacini idrici contaminati e nel corpo dell’ospite infetto, che pertanto risulta portatore asintomatico a lungo termine. Una maggior resistenza ne ha favorito la diffusione pandemica.

V. cholerae O139

V. cholerae O139 Bengal è una variante batterica che ha origine dal biotipo El Tor, riconosciuta come agente eziologico aggiuntivo del colera. Difatti determina un quadro clinico identico, solo raramente aggravato da batteriemia (presenza di batteri nel sangue). Questa variante, a differenza di V. cholerae O1, è incapsulata e pertanto maggiormente invasiva. Diffusosi per la prima volta nel sud dell’India (da cui il nome), il nuovo ceppo presenta un enorme vantaggio selettivo rispetto agli altri vibrioni colerici: è molto difficile da eradicare. Non a caso è comparso in regioni già colpite da epidemie di El Tor, per cui la maggior parte della popolazione aveva sviluppato l’immunità, non rispondente però all’infezione del ceppo variante.

V. cholerae O139 è resistente e assai adattabile all’ambiente: studi molecolari suggeriscono che abbia acquisito nuovi geni da un ceppo non O1 con modifica delle proprie caratteristiche antigeniche e geniche.

V. cholerae non O1/O139

I sierotipi non agglutinabili dall’antisiero O necessitano di una considerevole carica batterica per causare l’infezione. L’organo bersaglio è sempre l’intestino e la trasmissione è legata al consumo di acque e prodotti ittici contaminati o crudi/poco cotti. La sintomatologia comprende gastroenteriti lievi e forme diarroiche di serietà variabile, alcune simil-coleriche, altre simili a quelle causate da Escherichia coli enterotossico.

Nelle feci possono essere presenti muco e sangue. Questa evidenza è importante perché rimarca una prima disuguaglianza tra i ceppi non O1/O139 ed il sierogruppo O1. Anche se il meccanismo patogenetico di base non è ancora ben chiaro pare che V. cholerae non O1/O139 produca una tossina termostabile o determini un’invasione tissutale, a differenza dei vibrioni del colera.

Non sono stati trovati ceppi non O1/O139 associati ad epidemie.

Filogenesi

Dominio	Prokaryota
Regno	Bacteria
Phylum	Proteobacteria
Classe	Proteobacteria Gamma
Ordine	Vibrionales
Famiglia	Vibrionaceae
Genere	Vibrio
Specie	V. cholerae

Morfologia delle colonie

Il terreno di coltura preferenziale per la crescita dei vibrioni del colera è il TCBS (thiosulphate-citrate-bile salts-sucrose agar), che ha un pH molto alto in grado di inibire la crescita della maggior parte dei microrganismi non appartenenti al genere Vibrio. In questo caso si sfrutta la peculiarità del genere di prediligere un pH alcalino.

Vibrio cholerae cresce formando colonie gialle o verdi con il centro più opaco rispetto ai contorni (Figura 2). Questa differenza di colorazione dipende essenzialmente dalla velocità del ceppo in esame di metabolizzare il saccarosio presente nella formulazione del terreno: quelli che fermentano lentamente il saccarosio appaiono verdi.

v. cholerae in TCBS — *Figura 2 – Colonie* V. cholerae su TCBS. La combinazione di sali biliali e cloruro di sodio inibisce la crescita di batteri Gram-positivi e di molti batteri Gram-negativi esigenti da un punto di vista nutrizionale

Le colonie sono visibili dopo 18-24 ore d’incubazione e si presentano più o meno larghe, con diametro di 2-3 mm e leggermente appiattite. Solitamente sono lisce ma è possibile trovarle anche in forma rugosa. La lettura delle piastre va effettuata il prima possibile: se lasciate a temperatura ambiente o in frigo, le colonie gialle tenderanno a diventare verdi.

Su GA (gelatin agar) si sfrutta la capacità di alcuni ceppi di idrolizzare la gelatina formando un alone attorno alla colonia stessa. Le colonie appaiono così ruvide e trasparenti e la zona opaca è lungo i bordi. Caratteristica che si accentua se le piastre si lasciano in frigorifero. A luce obliqua il colore può virare invece dal verde al color bronzo.

Su GSA ( glucose salt agar) le colonie sono piccole e trasparenti, con un alone opaco tutto intorno.

Patogenesi

Vibrio cholerae è un agente patogeno con spiccato tropismo intestinale ed umano. Gli uomini infatti sono gli unici a rischio infezione. Una volta penetrato nell’ospite il batterio causa disturbi come diarrea ricorrente, crampi addominali, vomito e possibili complicanze extraintestinali: il tipico quadro clinico dovuto dall’azione di un’enterotossina.

II ceppi O1 e O139 determinano una sintomatologia più severa rispetto agli altri: la malattia, riconducibile a stati di shock per acidosi metabolica, ipokaliemia e insufficienza renale, prende il nome di colera e ad oggi è classificata come un’epidemia, endemica in zone circoscritte.

Nei Paesi in via di sviluppo infatti è ancora una delle malattie infettive più comuni, mentre è rara nel mondo industrializzato. I principali fattori di rischio per la diffusione del colera sono sicuramente le inadeguate condizioni e abitudini igienico-sanitarie, il mancato funzionamento dei sistemi fognari e di trattamento per l’acqua potabile e l’inquinamento delle risorse idriche.

Contribuiscono anche il breve periodo d’incubazione della malattia (meno di 5 giorni), il consumo di derrate alimentari contaminate e/o pesce crudo o con cottura inadeguata e la vicinanza a portatori asintomatici. Il colera può infatti presentarsi anche senza i classici sintomi e trasmettersi da uomo ad uomo per contatto diretto.

I cibi considerati più rischiosi per la salute sono i crostacei: V. cholerae prolifera molto più velocemente se associato ad organismi eucarioti, in particolare ai copepodi. Anche i molluschi sono pericolosi: grazie all’azione filtrante aspirano un elevato numero di vibrioni, accumulandoli. Altri animali acquatici, come ad esempio i pesci, rappresentano dei veri e propri serbatoi di V. cholerae, mentre gli uccelli acquatici ne sono responsabili di una diffusione su scala globale.

Tossina colerica

Ingerito, Vibrio cholerae aderisce alla parete intestinale tramite il flagello polare per poi rilasciare la tossina colerica (CTX), a sua volta codificata dal fago CTXφ, integrato nel genoma del vibrione. Il meccanismo d’azione di CTX (Figura 3) mira ad alterare la concentrazione intracellulare di c-AMP portando ad uno squilibrio nelle secrezioni di sali. Precisamente si blocca l’assorbimento di sodio e si promuove la secrezione di cloruri. Lo sbilanciamento elettrolitico causa diarrea profusa grave con scariche intense (fino a perdere 1 litro di liquidi all’ora) e disidratazione, da cui debolezza e dolori muscolari per fuoriuscita di potassio.

Da un punto di vista funzionale CTX è un’esotossina binomiale di tipo A-B, si compone ovvero di due frazioni proteiche:

La subunità A (active) che svolge l’attività, suddivisa in A1 e A2, tenute insieme da un ponte disolfuro;
La subunità B (binding).

azione tossina del colera — *Figura 3 – Meccanismo d’azione della tossina colerica*

Il compito di quest’ultima è di legarsi alla parete dell’intestino tenue tramite il recettore gangliosidico GM1 permettendo l’ingresso nella cellula per endocitosi. Qui le componenti A1 e A2 si dissociano e traslocano nel citosol dove provocano disfunzionalità delle proteine G. In questo modo si rende permanente l’attività dell’adenilato ciclasi ed i livelli di c-AMP aumentano, con conseguente squilibrio degli elettroliti nel lume intestinale.

Metodi di identificazione

Per una corretta identificazione di Vibrio cholerae è necessario anzitutto isolare le colonie. Sarà utile analizzare sia il materiale biologico umano, come feci e campioni extraintestinali, che la matrice alimentare. In primis acque da fonti sospette, molluschi bivalvi e crostacei, tenendo sempre conto del fatto che questi campioni possono essere facilmente contaminati da enterobatteri.

Si inizia con un esame colturale: Vibrio spp. crescono bene sulla maggior parte dei terreni generici per l’identificazione di Gram-negativi, come Agar MacConkey o la sua variante Agar Sorbitol MacConkey. Tuttavia, è più indicato l’utilizzo di terreni selettivi e differenziali come TCBS, eccellente per la crescita di tutti i vibrioni. APW (alcaline peptone water) si è dimostrato un ottimo brodo di arricchimento per la ricerca specifica di V. cholerae poiché contiene principalmente NaCl per mantenere l’equilibrio osmotico ed il pH di 8,4 – 8.6. APW è indicato per brevi periodi di incubazione, onde evitare la crescita della microflora competitiva che può essere presente in alcuni campioni, come quelli di origine alimentare.

I vibrioni di solito crescono difficilmente su altri terreni selettivi, come ad esempio TSI e KIA per gli enterobatteri. Le colonie sospette sviluppatesi su questi o su altri terreni non specifici per Vibrio spp. vanno testate con altre tipologie di esami di laboratorio.

Se si hanno a disposizione campioni di feci fresche V. cholerae può essere identificato direttamente esaminando il materiale in microscopia in campo scuro.

Test biochimici

La caratterizzazione biochimica consente l’accertamento dell’appartenenza ad una determinata specie e stipite batterico. Su Agar MacConkey le colonie di Vibrio cholerae risultano generalmente lattosio-negative (Figura 4).

v. cholerae su macconkey — *Figura 4 – Colonie* V. cholorae *su Agar MacConkey*. *Le colonie nell’immagine non sono lattosio-fermentanti perchè incolori*

Di seguito 10 proprietà biochimiche del batterio verificate in laboratorio (Figura 5):

Figura 5 – *Proprietà biochimiche di V. cholerae*

Per scongiurare il rischio di colonie false-positive è doveroso effettuare una mirata e minuziosa ricerca di V. cholerae saggiando le colonie per l’ossidasi: V. cholerae è ossidasi-positivo; gli enterobatteri ossidasi-negativi. Accertarsi inoltre della purezza delle colonie.

Di fronte ad un campione ancora poco chiaro è possibile effettuare la colorazione di Gram, che però da sola non è sufficiente per la diagnosi. Si procede quindi con semina su TSI e/o KIA, test presenza della citocromossidasi, test NaCl per la crescita e String test.

La richiesta di NaCl per la crescita è fortemente discriminante: con 0% NaCl cresce solo V. cholerae. Solo alcuni ceppi non O1 crescono all’1% NaCl e al 3% di NaCl e non allo 0% NaCl. Lo String test è invece meno accurato perché molte specie del genere Vibrio risultano String test-positive.

Saggi sierologici

La sierotipizzazione e la distinzione in biotipi non ha un peso concreto nella diagnosi di infezione, ma è importante per gli studi epidemiologici. In questa fase è estremamente importante avere colonie lisce per non pregiudicare la tipizzazione del ceppo in esame. A tal fine si utilizzano sieri polivalenti mentre la conferma sierologica si ha con sieri monovalenti.

Per la differenziazione del biotipo i test da effettuare sono riportati in tabella (Figura 6):

Figura 6 – *Test da effettuare per la differenziazione del biotipo di V. cholerae*

Va infine verificata l’effettiva produzione di tossina colerica. I metodi immunologici come ELISA e agglutinazione al lattice ed i test di tossigenicità in vitro sono le metodiche più comuni. Oppure si può procedere con la PCR delle sequenze geniche che codificano per la tossina stessa.

È bene ricordare che la ricerca di Vibrio cholerae deve essere sempre effettuata nelle acque destinate al consumo umano nell’ambito della verifica del parametro “Enterobatteri patogeni” sebbene la sua presenza non sia connessa a quella di altri patogeni enterici: lo si riscontra anche isolato in acque superficiali non inquinate da scarichi fecali.

Ricapitolando ecco un protocollo di isolamento e identificazione di Vibrio cholorae da campioni clinici umani (Figura 7):

protocollo identificazione — Figura 7 – *Protocollo di isolamento e identificazione di Vibrio cholorae*

Terapia

Ad oggi il tasso di mortalità del colera non è elevato, circa l’1% se i pazienti sono trattati adeguatamente subito dopo la diagnosi. In caso di mancato accesso alle cure può aumentare fino al 60%.

Nella maggior parte dei casi la terapia più efficace è anche la più semplice e consiste nella reidratazione del paziente con soluzioni ricche di zuccheri ed elettroliti. Durante gli episodi diarroici ed il vomito il corpo perde molti liquidi e sali minerali che è necessario reintegrare per correggere l’ipovolemia grave che si verifica in questa condizione. L’utilizzo di Ringer lattato con l’aggiunta di Na⁺ e K⁺ consentono una rapida ripresa dell’organismo.

Questo approccio è il primo da mettere in atto ed ha una buona percentuale di successo nel recupero del normale funzionamento dell’intestino. Nei casi più gravi l’integrazione di liquidi deve essere fatta per via endovenosa.

Il trattamento di tipo farmacologico del colera prevede l’utilizzo di antibiotici e di vaccini come strumento di prevenzione. Le tetracicline e la ciprofloxacina riducono la necessità di reidratazione in soluzione orale e attutiscono i sintomi della malattia. Tuttavia questo approccio è indicato solo per i casi più gravi mentre è sconsigliata come terapia nei bambini.

La somministrazione è singola e la validità discutibile poiché il batterio sviluppa resistenza. L’antibiotico eritromicina, appropriato anche per il trattamento dei più giovani, sembra maggiormente efficace ma la protezione non è comunque duratura nel tempo.

Profilassi

V. cholerae nel corso del XIX secolo ha causato ben 7 pandemie di colera. Ancora oggi è un enteropatogeno estremamente diffuso se non ubiquitario. Autoctono in diverse aree, la sua forza risiede nelle capacità di adattamento. In condizioni ambientali ostili ad esempio, resta vitale e metabolicamente attivo, anche se non è più in grado di moltiplicarsi.

Nei Paesi industrializzati una miglior gestione della sanità pubblica e la disponibilità di vaccini hanno aiutato a contenere e prevenire il contagio.

I vaccini sono generalmente somministrati solo ai viaggiatori che si recano nelle zone dove la malattia è ancora preoccupante ed endemica ed hanno un effetto transitorio, o comunque da confermare. Il vaccino più comune è Vaxchora ®, monovalente vivo e attenuato. È utilizzato in monodose orale ed è efficace contro il ceppo O1.

Il vibrione del colera è infine molto sensibile all’azione degli agenti fisici e può essere facilmente ucciso dagli acidi e da temperature non molto elevate (intorno ai 50°C). Come prevenzione si raccomandano quindi adeguate condizioni igienico-sanitarie, cottura dei cibi, disinfezione e purificazione delle acque.

Carla Caianiello