Il clonaggio genico è un insieme di tecniche di biologia molecolare che permettono l’introduzione di un gene di interesse in una molecola di DNA capace di replicarsi e l’amplificazione della molecola di DNA ricombinante ottenuta in una cellula ospite. Mediante il clonaggio, quindi, è possibile ottenere numerose copie di una determinata sequenza nucleotidica.
Per lo studio di geni eucariotici molto grandi, i genetisti ed i biologi molecolari hanno ideato vettori in grado di contenere e clonare sequenze di DNA lunghe in media 300 Kb sviluppando i cromosomi artificiali di lievito (YAC, yeast artificial chromosomes), i cromosomi batterici artificiali (BAC, bacterial artificial chromosomes) ed i cromosomi artificiali del fago P1 (PAC, P1 derived artificial chromosomes).
Gli YAC sono cromosomi artificiali inseriti in una cellula ospite di lievito possono ospitare frammenti di DNA lunghi da 200 Kb a 500 Kb. Per replicarsi, un cromosoma di lievito necessita di:
- origine di replicazione ARS (autonomously replicating sequence)
- due telomeri, strutture terminali del cromosoma;
- un centromero;
- un sito multiplo di policlonaggio;
- un marcatore selezionabile.
I cromosomi artificiali batterici BAC sono stati costruiti da fattori di fertilità F batterici e si replicano generalmente nel batterio Escherichia coli.
Gli elementi strutturali necessari alla loro costituzione sono:
- geni oriS e repE che consentono la replicazione;
- geni parA e parE responsabili della ripartizione di un solo vettore per cellula;
- marcatore selezionabile, generalmente gene CMr che codifica per la resistenza all’antibiotico batteriostatico cloramfenicolo prodotto dal batterio Stremptomyces venezuelae;
- MCS (multiple cloning site) o polilynker;
- siti di riconoscimento per i promotori fagici T7 e SP6 fiancheggianti i siti di clonaggio per la trascrizione dei geni dell’inserto;
- sito di restrizione cosN per l’enzima terminasi;
- sito di riconoscimento loxP per la proteina CRE.
I cromosomi artificiali derivati dal fago P1può contenere grandi inserti lunghi fino a 300 Kb.
Grazie alla presenza nella sua struttura del gene P1 replicon che conferisce al vettore la caratteristica di replicazione unidirezionale ed una bassa percentuale di ricombinazione interna, è presente in una o due copie.
Oltre al gene P1 replicon, gli elementi strutturali dei cromosomi PAC sono i seguenti:
- gene KanR che codifica per la resistenza all’antibiotico amminoglicoside canamicina come marcatore selezionabile;
- sito di clonaggio BamH1;
- siti di riconoscimento per i promotori fagici SP6 e T7 che fiancheggiano i siti di clonaggio per la trascrizione dei geni dell’inserto e per la costruzione di sonde ad RNA per il chromosome walking;
- sistema di selezione negativa per i vettori che non contengono l’inserto rappresentato dal gene sacB del batterio Bacillus subtilis: il gene sacB codifica per l’enzima levan saccarasi che catalizza il trasferimento dello zucchero semplice fruttosio a vari carboidrati. Le cellule di E. coli che crescono in un terreno contenente saccarosio al 5% muoiono in presenza dell’enzima levan saccarasi. L’inserzione di un frammento di DNA estraneo in un sito di restrizione BamH1 inattiva il gene sacB codificante l’enzima. I vettori con l’inserto di DNA estraneo, dunque, possono crescere su un terreno che contiene saccarosio al 5%.
La possibilità di ottenere inserti lunghi dai vettori artificiali costruiti a partire da cromosomi di leviti e di microrganismi batterici e batteriofagi ha permesso l’utilizzo di questi ultimi nel Progetto Genoma Umano.
Maria Chiara Langella
Fonti:
Immagine in evidenza da http://www.molecularlab.it/clonaggio/vettori/bac-pac.asp
Principi di genetica. Quarta edizione. D. Peter Snustad e Michael J. Simmons. Edises. 2015. Pag. 428.
http://www.molecularlab.it/clonaggio/vettori/bac-pac.asp
http://www.summagallicana.it/Volume2/B.XVIII.08.6.htm
