Colorazione di Ziehl - Neelsen (Carbolfucsina a caldo)

Obiettivo della tecnica

La colorazione di Ziehl – Neelsen viene utilizzata in microscopia ed in batteriologia per la ricerca dei micobatteri, con particolare riguardo al Mycobacterium tuberculosis che in clinica è il responsabile della tubercolosi. Esistono però altre specie da non sottovalutare, di più raro riscontro rispetto al M. tuberculosis ma comunque molto patogene, come il Mycobacterium leprae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum e tutti quelli afferenti ai Mycobacterium avium complex.

Assieme alla colorazione fluorocromica con Auramina, è la metodologia d’elezione per confermare eventuali patologie ad eziologia micobatterica.

I micobatteri, a causa della conformazione della loro parete cellulare ricca in lipidi e cere, vengono considerati alcool – acido resistenti e quindi al momento dell’identificazione microscopica necessitano di ulteriori passaggi e metodiche più specifiche a differenza di altri microorganismi.

Che cos’è e come funziona

Questa colorazione prende il nome da due medici tedeschi: il microbiologo Franz Ziehl ed il patologo Friedrich Neelsen. È conosciuta anche come “carbolfucsina a caldo“: la carbolfucsina è il colorante primario che i micobatteri tratterranno e viene svolta a caldo poiché il vetrino deve essere necessariamente riscaldato su fiamma prima di essere colorato.

Rientra tra la colorazioni differenziali e di contrasto, in cui vengono utilizzate più sostanze a cui i micobatteri (e, qualora sia presente, l’altra popolazione batterica diversa da questi) andranno a legarsi. I coloranti differenziali, usati generalmente come secondari, permettono sempre la discriminazione di altri microorganismi diversi da quelli che stiamo ricercando.

Il colorante primario, come accennato in precedenza, è la carbolfucsina mentre il colorante secondario è quasi sempre il blu di metilene. In altre metodiche possiamo però trovare il verde malachite.

Al termine della colorazione, i micobatteri che non si decolorano con la miscela acido – alcool, assorbiranno la carbolfucsina apparendo al microscopio come piccoli bacilli colorati di rosso – fucsia. Al contrario, tutta l’ulteriore popolazione batterica diversa dalla precedente che subirà la decolorazione, sarà visibile come uno sfondo blu poiché assorbirà il blu di metilene.

Materiale occorrente

un vetrino portaoggetto per microscopio su cui è posizionato il materiale biologico da analizzare, precedentemente fissato;
fucsina basica fenicata (carbolfucsina) di Ziehl: preparare una soluzione contenente 0,3 g di fucsina basica in 10 mL di etanolo al 95%. Sciogliere inoltre 5 g di fenolo cristallizzato in 100 mL di acqua distillata e mescolare i 10 mL della soluzione di fucsina con 90 mL della soluzione acquosa di fenolo. Quest’ultimo viene aggiunto come mordenzante;
decolorante: aggiungere 3 mL di acido cloridrico concentrato a 97 mL di etanolo al 95%.
blu di metilene (colorante di contrasto): sciogliere 0,3 g di blu di metilene cloruro in 100 mL di acqua distillata.

Procedimento

coprire totalmente il vetrino con carbolfucsina di Ziehl. Scaldare lentamente, fino alla formazione dei primi vapori, passando sotto il vetrino la fiamma di un batuffolo di cotone impregnato di alcol. Questo passaggio deve essere svolto rigorosamente sotto cappa chimica poiché i vapori che si sviluppano sono tossici.
lavare con acqua di fonte;
decolorare con la miscela acido-alcol effettuando più passaggi ognuno di 30 secondi, fino a quando nel liquido di lavaggio non vi è più traccia di colorante;
lavare di nuovo con acqua di fonte;
aggiungere il colorante di contrasto (blu di metilene) per almeno 30 secondi;
lavare con acqua di fonte e lasciar asciugare all’aria;
leggere al microscopio ottico.

Osservazione del vetrino

La lettura del vetrino viene svolta con un semplice microscopio ottico. Il livello di ingrandimento utilizzato e d’elezione è un 100x ad immersione (“oil”) .

I bacilli acido – alcool resistenti appariranno nitidamente rossi / fucsia su uno sfondo totalmente blu dato dal colorante di contrasto in cui saranno presenti tutti gli altri batteri non acido – alcool resistenti.

Figura 1 – Micobatteri al microscopio: la caratteristica colorazione fucsia data dalla Carbolfucsina li rende ben visibili e differenziati dallo sfondo bluastro.