"Eme": l'anello chimico che arresterà il Toxoplasma

Cosa avranno in comune un parassita temuto proverbialmente in gravidanza come il Toxoplasma gondii ed una molecola chimica ad anello, l’eme, che caratterizza la tipica capienza sanguigna animale? Per mettere bene a fuoco la portata di questo nuovo studio bisognerà considerare l’eme come un clichè condiviso da animali, microbi e vegetali. Su questo, ogni regno avrà, certo, apposto il proprio sigillo differenziale, sfruttandolo, intanto, per il medesimo scopo. Respirare. Cioè trasportare gas dentro e fuori da un sè ed inventare intorno a questo mirabile artificio una durata prolifica. Una vita.

Toxoplasmosi: il terrore delle gestanti

Il protozoo intracellulare obbligato, Toxoplasma gondii, deve il suo nome alla forma delle sue cellule: τόξον, tòkson «arco» e πλάσμα, plàsma «formazione». Tali sporozoi coccìdei, infatti, hanno forma a mezzaluna (Fig.1) e parassitano mammiferi ed uccelli. La zoonosi viene trasmessa dal gatto, unico ospite definitivo ed asintomatico, ad ospiti intermedi. In essi, il parassita genera cisti tissutali.

Quando l’infezione viene contratta da una donna in gestazione può causare gravi alterazioni nel feto: il parassita è, infatti, in grado di attraversare la barriera placentare. I danni al nascituro dipendono dalla fase di gestazione in cui si contrae l’infezione e comprendono gravi alterazioni del sistema nervoso centrale, della vista e dell’udito. Di solito, però, gli esseri umani acquisiscono l’infezione per ingestione di oocisti contaminanti il suolo e rilevabili poi su frutta e verdura, oltre che nelle acque libere. Cisti tissutali del parassita, inoltre, sono notoriamente presenti anche nelle carni poco cotte (Fig.2).

Anche i patogeni hanno un “eme”

Il gruppo chimico, noto come “eme”, perchè in greco αἷμα, aìma, significava «sangue», rappresenta, infatti, il gruppo prostetico (cofattore) dell’emoglobina e di altre cromoproteine respiratorie, come mioglobina e citocromi, alla quale conferisce il colore rosso. Ma non solo. L’eme, con il suo atomo centrale di ferro, concede alla proteina di pertinenza la capacità di legare reversibilmente molecole di ossigeno, così che siano trasportate ovunque risultino indispensabili (Fig.3). Si dica, perciò, che il sangue non sia acqua, grazie al ferro.

Il gruppo eme dell'emoglobina animale, confrontato con la struttura della clorofilla vegetale, mostra somiglianze interessanti. — *Figura 3 – Il gruppo eme, presente nell’emoglobina mostra straordinarie e comprensibili somiglianze con la molecola della clorofilla.*
Esse hanno, infatti, **porfirine** simili, cioè strutture eterocicliche che trasportano
composti essenziali per la vita.

Il gruppo eme è idealmente essenziale, in effetti, per tutti gli esseri viventi, proprio perchè è sempre cofattore di proteine coinvolte in svariate funzioni cellulari. Dal trasporto di atomi gassosi alla funzione di biosensori, dalla costante detossificazione alla respirazione mitocondriale, le proteine hanno qualifica e fama ben meritate. Da quasi un secolo, sappiamo anche che i nostri mondi, i nostri regni terrestri, si somigliano per un motivo: comunicare.

Storiche affinità elettive

Era il 1934 quando Paul Rothemund scoprì che le porfirine della clorofilla contribuivano alla
sintesi dei globuli rossi del sangue in un certo numero di animali, quando ad essi venivano somministrate piccole dosi di tale pigmento vegetale.
Poi nel ’36 Hughes e Latner, a seguito di esperimenti su conigli anemici, dimostrarono che la clorofilla nel cibo, insieme a piccole dosi di clorofilla purificata, potevano stimolare la sintesi dei globuli rossi a partire dal midollo osseo.

Ed infine, nel 1970, Hammel-Dupont e colleghi scoprirono che le porfirine stimolavano la sintesi della globina (la parte proteica dell’emoglobima). In più, molti elementi nutritivi miglioravano la circolazione sanguigna ed erano quelli presenti in alimenti ricchi di clorofilla, compresi i grassi vegetali. Si trattava di micronutrienti e minerali, vitamina K, vitamina C, acido folico, ferro, calcio, tutti gentilmente forniti da fonti alimentari di clorofilla.

Microbiche intersezioni

E perchè non i patogeni? Perchè mai i microrganismi avrebbero dovuto fare eccezione. Perchè, in un crocevia insondabile ma innegabile, in cui le strutture micromolecolari si specchiano una nell’altra, gli organismi più prossimi ad un abbozzo animale avrebbero dovuto mancare di relazioni d’ordine con il mondo cui tenacemente si aggrappano, con ogni lecito od illecito mezzo biochimico? I protozoi patogeni umani condividono, dunque, alcune vie biosintetiche di nutrienti con le loro controparti ospiti, pur con caratteristiche differenti.

Nel phylum degli Apicomplessi, Toxoplasma gondii e Plasmodium spp., per esempio, possiedono un genoma che codifica per enzimi afferenti alla via biosintetica del proprio gruppo eme completo. Ben 8 enzimi biosintetici del gruppo eme risiedono all’interno di tale via, dislocati in tre localizzazioni subcellulari dei parassiti: mitocondri, citoplasma ed apicoplasti. Gli apicoplasti possono definirsi residui di cloroplasti, tipici di questo phylum.

Ma il Toxoplasma gondii codifica anche per due ortologhi di emoproteine, quali citocromo P450 (cyt P450) e catalasi. Questo non può che suggerire che l’eme sia coinvolto nella detossificazione di questo patogeno. Diversamente, l’agente eziologico della malaria, il Plasmodium spp., manca di entrambi i geni ortologhi.

Eme microbico autarchico

Come ogni parassita intracellulare, il Toxoplasma gondii utilizza la membrana cellulare dell’ospite per crearsi un compartimento privato di replicazione: un vacuolo parassitoforo (PV). La membrana di questo vacuolo è permeabile a piccoli soluti, poichè dotata di pori il cui cut-off corrisponde a 1300 Da. Le molecole di eme sono molto più piccole di 1300 Da, ma allo stato libero risultano tossiche perciò è improbabile trovarlo in questa forma. Esse sono prevalentemente associate a proteine o piccoli ligandi che, nel loro insieme, compongono un pool labile di eme cellulare, nei mammiferi.

Pare, dunque, poco probabile che Toxoplasma gondii sia capace di acquisire eme libero dall’ospite, attraverso i pori della membrana vacuolare. L’unico modo in cui il protozoo potrebbe giovarsi dell’eme dell’ospite sarebbe ricavarlo dalla digestione delle sue emoproteine.

Sintesi de novo di eme in Toxoplasma gondii

Studi precedenti avevano già espresso una forma enzimatica ricombinante di porfobilinogeno sintasi di Toxoplasma gondii (TgPBGS), in E.coli. Si trattava del secondo enzima della via biosintetica dell’eme. Successivamente Bo Wu, dell’Università della Pennsylvania, scoprì che il succinilacetone (SA) fosse un inibitore della crescita intracellulare di Toxoplasma gondii, già a metà della sua massima concentrazione (IC₅₀ ~ 2 mM).

Questo gettò nuova luce sul potenziale terapeutico della manipolazione molecolare della catena biosintetica dell’eme, sulla temutissima toxoplasmosi. Ma a chiarire bene la rilevanza della catena di sintesi dell’eme nei patogeni protozoi, arrivò lo studio CRISPR sull’intero genoma di Toxoplasma gondii: i ricercatori guidati da Saima M. Sidik calcolarono, infatti, il punteggio d’idoneità di tutti gli 8 geni codificanti per altrettanti enzimi di biosintesi dell’eme. Il risultato si attestò sotto -2.7 e con ciò si affermò che tale via biosintetica fosse cruciale per la crescita parassitaria nelle cellule dell’ospite.

Tuttavia la biosintesi de novo dell’eme mostrò schemi differenti, all’interno dello stesso phylum degli Apicomplessi. Da ricerche ortologiche, infatti, molti altri omologhi patogeni umani ed animali (Cyclospora cayetanensis, Cystoisospora suis, Eimeria tenella, Neospora caninum, etc.) codificavano invece per la via biosintetica dell’eme solo in parte. Le cause furono ricercate nella mancanza di geni idonei o nella differenziazione delle sequenze primarie.

“Eme”: il cuore della toxoplasmosi

Restava solo da chiarire se l’intera via enzimatica di biosintesi dell’eme fosse attiva proprio con infezione in corso. La toxoplasmosi conclamata correla, dunque, in qualche modo, con la produzione microbica di eme?

L’ultimo studio

Per verificare se tutti gli 8 geni codificanti per gli enzimi della catena biosintetica dell’eme, in Toxoplasma gondii, fossero espressi in fase di infezione acuta, i ricercatori guidati da Amy Bergmann hanno inserito degli epitopi marcatori alle estremità c-terminali. Così, tecniche di immunoblotting hanno potuto rilevare la attiva espressione di questi geni durante toxoplasmosi acuta.

Inoltre, esperimenti di localizzazione con fluorescenza hanno, poi, confermato che Toxoplasma gondii delocalizza la biosintesi dell’eme tra mitocondri, membrana cellulare e gli apicoplasti. In particolare è emerso come i protozoi conservino i componenti e gli intermedi di reazione della via dell’eme, durante le fasi più critiche della zoonosi acuta.

Poichè era chiaro, allora, che il Toxoplasma gondii potesse contare sia sulla propria produzione emica de novo, sia sulla acquisizione di intermedi dell’ospite, per sostenere i propri attacchi infettivi all’ospite, i ricercatori hanno sottratto un tassello. Il primo enzima della via biosintetica, acido 5-aminolevulinico sintasi (TgALAS) è stato rimosso in un ceppo originario (wild type) e ciò avrebbe duvuto bloccare la sintesi de novo, senza interferire minimamente con l’acquisizione degli intermedi dell’ospite. Ma variazioni enzimatiche (Δalas) nel normale mezzo di coltura sono fallite finchè, al mezzo di coltura, i ricercatori hanno aggiunto 300 μM di ALA, il prodotto dell’enzima TgALAS. La produzione de novo di eme pare, dunque, sia essenziale per la stessa infezione parassitaria.

Altre controprove, condotte con l’ausilio di wild type e mutanti di Toxoplasma gondii, hanno tuttavia chiarito l’esistenza anche di una riserva di eme microbico, in grado di coprire le richieste proliferative anche in contingenze sfavorevoli per i parassiti.

Se puoi distinguerlo, puoi fermarlo

L’aggiunta di ALA al mezzo di coltura, dunque, migliorava la replicazione parassitaria. Da questo si è evinto che la via biosintetica individuata per l’eme, nei parassiti, fosse decisamente responsiva a stimoli chimici esogeni.

Gli attuali antibiotici contro il Toxoplasma gondii comportano notevoli effetti collaterali e mostrano anche molti limiti terapeutici sulla toxoplasmosi congenita. Urge quindi una nuova strategia anti-zoonosica.

Nelle piante, l’enzima coinvolto nella produzione di eme e clorofilla è la protoporfirinogeno ossidasi (PPO). Arcinoto è il ruolo della clorofilla nella fotosintesi, ovvero nella foto-nutrizione vegetale con liberazione d’ossigeno, così urgente per noialtri. Quando l’attività enzimatica della PPO viene inibita, il protoporfirinogeno IX si disperde nel citosol e si ossida spontaneamente a protoporfirina IX. Essa può assorbire luce e produrre ossigeni singoletti altamente reattivi, capaci di distruggere le membrane vegetali. Per questo la PPO è stata ampiamente riconosciuta come target per lo sviluppo di erbicidi efficaci.

In fondo l’eme è una “livella”

Da un confronto operato tra sequenze primarie di PPO di mammiferi, piante, funghi, protozoi e batteri è emerso che il TgPPO in Toxoplasma gondii sia, in realtà, più strettamente correlato agli ortologhi vegetali che a quelli animali.

A seguito di test su 11 erbicidi commerciali, inibitori di PPO di Toxoplasma gondii, 5 composti sono emersi più efficienti degli altri (IC₅₀ 130 – 650 μM) nella inibizione di crescita parassiatria. Ma in assoluto il migliore si è rivelato l’ossidiazone. Tale erbicida risulta, inoltre, potenziato di 15-25 volte in presenza di due suoi derivati. Servirà, tuttavia, un futuro studio di follow-up per esplorare il meccanismo molecolare sotteso a questa vittoria su una parassitosi tra le più subdole e spietate.