I terreni di coltura: caratteristiche, storia, utilizzi, applicazioni

Introduzione sui terreni di coltura

La microbiologia è stata ampiamente sviluppata grazie alla scoperta e all’ottimizzazione dei terreni di coltura a partire dal diciannovesimo secolo (vedi la pagina dedicata di Microbiologia Italia). La coltura batterica è stata il primo metodo sviluppato per studiare il microbiota umano, utilizzando un terreno artificiale che consenta la crescita e l’isolamento dei batteri. Il primo ad aver coltivato un batterio in modo riproducibile fu Louis Pasteur nel 1860, grazie allo sviluppo del primo cosiddetto terreno di coltura artificiale.

Storia e nascita dei terreni di coltura

Le origini dei terreni di coltura risalgono al 19° secolo, quando la scienza della microbiologia era solo agli inizi. Uno dei primi microrganismi (Serratia marcescens) appariva come colonie rosse sul pane conservato in atmosfera calda e umida. L’evoluzione della microbiologia è stata resa possibile sfidando la teoria della generazione spontanea, secondo la quale gli organismi viventi potrebbero svilupparsi da materia morta o in decomposizione e quindi apparire spontaneamente nelle colture.

Pasteur sviluppò un terreno di coltura contenente “zuppa di lievito”, ceneri, zucchero e sali di ammonio. Il suo obiettivo era dimostrare che ogni fermentazione (alcolica, acetica, lattica) era associata allo sviluppo di un particolare microrganismo. La presenza di questi diversi elementi gli permise di osservare che alcuni componenti favoriscono la moltiplicazione batterica, mentre altri la inibiscono. Infatti, in uno studio sulla fermentazione alcolica della birra Pasteur notò che quando questa era acida, al microscopio era possibile vedere “minuscole bacchette sagomate che producevano acido lattico“, cosa che non avveniva quando la birra era sana.

Nel 1881, Robert Koch osservò una crescita ottimale dei batteri quando venivano incubati in un brodo composto da siero di manzo fresco o estratto di carne solo quando il mezzo di coltura era solido. Infatti, l’uso di un mezzo di coltura liquido non produceva colture batteriche pure. Per ottenere un mezzo di coltura solido, Koch aggiunse inizialmente gelatina al brodo. Tuttavia, la gelatina presentava alcuni limiti poiché diventava liquida a temperature superiori a 25 °C. L’intuizione per la risoluzione venne da una delle sue assistenti, Fannie Hesse, che usava l’agar per solidificare le sue marmellate; Koch sostituì la gelatina con l’agar, il che permise di ottenere agar solidi, isolando i batteri.

*Figura 1- Evoluzione dei terreni di coltura: dalla prima coltura batterica (1673) alla colturomica.*

Caratteristiche e classificazione dei terreni di coltura

Caratteristiche:

concentrazione adatta di nutrienti per la crescita batterica;
adeguato grado di umidità;
pH adatto;
sterili e protetti da qualsiasi inquinamento.

Classificazione in base allo stato fisico:

Terreni LIQUIDI (brodi): Nei terreni di coltura liquidi, chiamati anche brodi di coltura, i nutrienti vengono disciolti in acqua. La crescita di batteri in questo tipo di terreno può essere dimostrata dalla comparsa di una torbidità. È difficile isolare un batterio specificamente in questo tipo di terreno;
Terreni SOLIDI: I terreni di coltura solidi (Fig.2) si ottengono aggiungendo un agente gelificante, come l’agar, al brodo di coltura. Consentono di ottenere colonie isolate di diverse specie batteriche.

*Figura 2- Terreni di coltura solidi su capsula petri*

Composizione e arricchimento

Un terreno di coltura arricchito è un terreno a cui sono stati aggiunti elementi essenziali per la crescita dei batteri. In particolare, per crescere, i batteri hanno bisogno di un minimo di nutrienti: acqua, una fonte di carbonio, una fonte di azoto e alcuni sali minerali.

L’acqua gioca un ruolo fondamentale nel solubilizzare i nutrienti, trasportarli e garantire reazioni di idrolisi. Alcuni batteri hanno bisogno di acqua libera per la loro crescita.

Il carbonio è l’elemento costituente più abbondante nei batteri. È essenziale che i batteri producano molecole di carbonio, come grassi, carboidrati semplici (zuccheri) e proteine.

Per quanto riguarda le fonti di azoto, sono numerose e si possono trovare in un gran numero di composti utilizzati nella composizione di un mezzo di coltura. L’azoto consente ai batteri di sintetizzare le loro proteine.

Infine, tra i comuni sali minerali, si trovano regolarmente fosfato, solfato, magnesio o calcio.

Fattori di crescita

Alcuni batteri necessitano di elementi specifici per crescere. A volte è necessario aggiungere fattori di crescita ai terreni di coltura per aumentare la moltiplicazione dei batteri. I fattori di crescita sono molecole nutrizionali (di origine naturale o sintetica) che i batteri non sono in grado di sintetizzare dai nutrienti disponibili nell’ambiente. I fattori di crescita sono richiesti in piccole quantità nel terreno di coltura. Tra i vari fattori di crescita abbiamo: amminoacidi (costituenti delle proteine), vitamine, sangue o sieri animali.

Preparazione e tecniche di semina

1. Pesata degli ingredienti
2. Dissoluzione degli ingredienti
3. Correzione del pH
4. Distribuzione nei recipienti (terreni liquidi)
5. Sterilizzazione terreni (calore umido: agar e brodi; filtrazione: brodi)
6. Distribuzione in capsule di Petri (terreni solidi)
7. Controllo della sterilità dei terreni

preparazione di un terreno di coltura — *Figura 3- Preparazione di un Terreno di coltura*

Nell’ambito microbiologico, la semina è il trasferimento dei microrganismi dal loro ambiente naturale. Tra queste, ricordiamo la semina per isolamento (o striscio): questo tipo di semina è molto utilizzata in ambito microbiologico per isolare colonie batteriche tramite striscio sul terreno di coltura. Lo striscio avviene mediante utilizzo di un’ansa sterile (sterile in quanto bisogna evitare contaminazioni crociate con altri microrganismi). Tale tecnica prevede movimenti ampi sulla piastra in modo da disperdere le varie cellule presenti sull’ansa (cellule prese da una brodocoltura, soluzione in cui sono presenti ceppi puri).

Altre tecniche che vengono utilizzate sono la semina su agar a becco di clarino e la semina per Infissione. L’agar a becco di clarino è un agar presente su una provetta inclinata, in modo da facilitare l’asportazione della patina, mentre la semina per infissione prevede l’utilizzo di una provetta e di un ago da inoculo.

Figura 4: Semina su agar a becco di clarino — Figura 4 – *Semina* su *agar* a *becco* di *clarino*

Conclusioni sui terreni di coltura

Negli ultimi anni, l’utilizzo di nuovi terreni di coltura ha consentito l’arricchimento del repertorio batterico attraverso l’isolamento di nuove specie batteriche. Ciò dimostra che, nonostante l’abbandono della coltura da parte di un gran numero di microbiologi, i terreni di coltura rimangono uno strumento fondamentale per i batteriologi per l’isolamento dei batteri commensali ma anche patogeni. Studiare l’ambiente naturale dei batteri che sono rimasti fino ad oggi incolti sarebbe interessante perché fornirebbe gli elementi essenziali per la crescita dei batteri. Infatti, sebbene ci siano molti terreni di coltura arricchiti, ogni batterio è unico e ha requisiti specifici.

Fonti

M. Bonnet1, J. C. Lagier1,2, D. Raoult1,2 and S. Khelaifia1,2
Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical microbiology. 8th ed. Philadelphia: Elsevier Health Sciences; 2015.
Sandle T. History and development of microbiological culture media. J Inst Sci Technol 2011:10–4.
Vallery-Radot P. Les œuvres de Pasteur. Paris: Masson et compagnie; 1922. p. 2.
https://scholar.google.com
https://www.microbiologiaitalia.it