Il PAP-test e la colorazione di Papanicolaou: principi ed utilizzo

La colorazione di Papanicolaou è una colorazione tricromica che si utilizza nell’ambito della citologia diagnostica per colorare le cellule. In particolare, nel caso della citologia del collo dell’utero si utilizza per effettuare il PAP-test.

Il PAP-test permette di apprezzare la fase di maturazione delle cellule, di identificare alterazioni dovute ad infezioni batteriche o virali e di valutare la predisposizione allo sviluppo del cancro.

George papanicolau — *Figura 1 – George Papanicolau*

Questa tecnica prende il nome dal medico greco-americano G eorge Papanicolaou (Figura 1), che sviluppò questo test proprio per la diagnosi rapida dei tumori dal collo dell’utero.

I principi della colorazione

Essa si basa sulla combinazione di una colorazione nucleare (a base di ematossilina) e di due contro-colorazioni citoplasmatiche (a base di OG-6 e EA-50):

Il primo, l’OG-6 (Orange G) colora la cheratina dall’arancio brillante al giallo;
Il secondo, l’EA, è invece una miscela di due coloranti: Eosina e Verde Luce. La prima delle due colora il citoplasma delle cellule pavimentose mature superficiali di rosa, dette eosinofile. Il Verde Luce, invece, colora il citoplasma delle cellule più immature (para-basali o basali) di verde-celeste dette cianofile (Figura 2).

Differenze nella colorazione di Papaniicolau — *Figura 2 – Differenze nella colorazione di Papanicolau*

La tecnica di prelievo

Per eseguire questo test diagnostico, è necessario preparare un campione di cellule epiteliali, prelevate mediante tecnica esfoliativa. Generalmente, per prelevare le cellule si utilizza la spatola di Ayre (Figura 3), una sottile asticella in legno o in plastica, in grado di adattarsi alla convessità del collo dell’utero. Dopo il prelievo, si striscia l’estremità sul vetrino in modo da depositare le cellule e poi fissarle.

Per un risultato ottimale, le cellule sul vetrino non si devono asciugare all’aria prima della fissazione o durante il processo. Infatti, questo potrebbe creare artefatti.

Tipologia di colorazione

In questa tecnica, i nuclei delle cellule si colorano per primi. Per far questo si possono utilizzare due diverse tipologie di tecniche:

Progressiva, secondo la quale la soluzione di ematossilina viene aggiunta progressivamente, fino a raggiungere l’intensità desiderata
Regressiva, in cui si sovra-colorano le cellule e la soluzione colorante in eccesso si elimina mediante dei lavaggi acidi.

Tra queste due, la colorazione regressiva rende possibile una migliore differenziazione delle strutture bersaglio.

Tecnica e procedura

Una volta fissate le cellule mediante una miscela di etanolo assoluto ed etere etilico, i passaggi per effettuare la colorazione sono i seguenti:

NUCLEI: il vetrino passa in alcool a concentrazioni decrescenti fino ad acqua distillata, poi si aggiunge ematossilina di Harris per 2-8 minuti, che colora i nuclei in blu-viola;
Si lava con acqua distillata e poi con acqua di fonte per scaricare il colore in eccesso;
CELLULE MATURE: si passa il vetrino nell’Orange G per 5-6- minuti e poi si effettuano 2 passaggi in alcool 95%, per colorare le cellule mature;
CELLULE SQUAMOSE: si passa poi il vetrino nel colorante EA-50 (per gli strisci vaginali) e di nuovo si effettuano 2 passaggi in alcool 95%, per colorare le cellule squamose;
In ultimo si fanno 2 passaggi in alcool assoluto e infine in xilolo e balsamo.

I risultati della colorazione

Innanzitutto, le cellule appaiono con i nuclei in blu/viola. Le cellule acidofile vanno dal rosso all’arancio, mentre le cellule basofile dal blu al verde. Nello striscio vaginale questa colorazione consente di valutare la morfologia degli elementi cellulari, considerando anche le modificazioni che avvengono in tali elementi nelle varie fasi del ciclo.