La difficoltà nel coltivare i virus pone diversi problemi nella comune pratica di laboratorio per la loro ricerca, conteggio e identificazione.
I virus essendo per definizione “endoparassiti endocellulari obbligati” non si moltiplicano all’esterno della cellula ospite, quindi occorre coltivarli in colture batteriche (batteriofagi), cellule animali o vegetali.
Il corretto mantenimento delle colture cellulari implica una serie di accorgimenti rigidi e sofisticati, effettuati in strutture altamente specializzate. I virus batteriofagi sono invece coltivabili molto più facilmente sulle colture batteriche, ed è grazie ad essi che la virologia moderna ha avuto i suoi enormi progressi.
Prima di passare alle varie tecniche di coltivazione dei virus, è bene chiarire la definizione di batteriofago: “si definiscono batteriofagi, o più comunemente fagi, virus parassiti dei batteri, dai quali vengono replicati e di cui generalmente inducono la lisi (disgregazione cellulare).”
Tornando alle tecniche di coltivazione dei virus abbiamo:
Coltivazione dei batteriofagi
Si avvale del metodo delle placche per la ricerca e il conteggio dei batteriofagi.
La tecnica prevede l’allestimento di una miscela composta dalla sospensione virale di cui si vuole determinare la concentrazione, una sospensione di batteri ospiti e agar fuso alla temperatura di 45-50°C. La miscela viene versata in una piastra Petri sterile, che solitamente contiene già uno strato di agar nutritivo.
I batteri crescono nello spessore dell’agar formando una patina uniforme. Quando i virus iniziano a replicarsi, formano nella patina batterica aree di lisi, tanto più numerose quanto più elevata la concentrazione dei virus nell’inoculo, che prendono il nome di placche di lisi.
La concentrazione virale iniziale corrisponde al numero di placche formate, e viene indicata come unità formanti placche.
Coltivazione di virus animali
Per coltivare i virus animali è possibile utilizzare animali vivi, colture cellulari oppure uova embrionate. Per la coltivazione occorre inocularli in topi, cavie e conigli.
In questo modo possono essere studiate le modalità della risposta immunitaria dell’organismo nei confronti dell’infezione virale.
L’animale viene continuamente posto in osservazione per monitorare la malattia e la sua evoluzione, oppure viene sacrificato dopo un certo tempo per valutare gli effetti del virus e ricercare virus nei tessuti infetti.
Coltivazione dei virus in uova embrionate
Molti virus animali possono essere coltivati in uova di pollo embrionate. La sospensione virale viene iniettata (dopo aver perforato il guscio dell’uovo) nella cavità amniotica o allantoidea.
Lo sviluppo dei virus si può notare dalla morte dell’embrione o da danni cellulari di lieve-medio entità. Questa tecnica di coltivazione è impiegata soprattutto per la coltivazione dei virus con cui preparare i vaccini virali.
Nelle uova embrionate si possono coltivare una moltitudine di virus in concomitanza dei punti in cui vengono iniettate le sospensioni virali:
- Inoculazione sulla membrana corion-allantoidea, sito ideale per la crescita di virus erpetici, dei poxvirus e del virus del cimurro del cane; provocano lesioni che appaiono come alterazioni macroscopiche circoscritte chiamate pocks (pustole);
- Inoculazione nella cavità allantoidea, sito ideale per la produzione di alte quantità di orthomyxovirus e paramixovirus da impiegare a scopo vaccinale;
- Inoculazione nella cavità amniotica, isolamento dei virus influenzali;
- Inoculazione nel sacco vitellino, adatta alla coltivazione delle clamidie.
Fonti:
- Fabio Fanti Biologia. Microbiologia e biotecnologie
- Laboratorio di Microbiologia
- Euderi Lanciotti- Biologia e microbiologia sanitaria
