HPV – Papillomavirus umano

Virione maturo di papillomavirus HPV
Figura 1- Papillomavirus

Caratteristiche

I papillomavirus sono gli agenti eziologici di verruche, papillomi, condilomi e altre neoformazioni benigne. Possono anche causare tumori maligni della cute e delle mucose che nell’umano possono interessare il collo dell’utero, la vulva, la vagina, la regione peniena, anale, perineale, orale, faringea e laringea.

Sono stati identificati più di 100 tipi di papillomavirus umani, classificati in base all’omologia del DNA, al tropismo tissutale e al potere oncogeno.
È proprio in base a quest’ultimo che possiamo suddividere gli HPV in:

  • High risk –> 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 69, 73, 82.
  • Low risk –> 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 57, 61, 84.

HPV codifica per delle proteine capaci di iniziare la sintesi di DNA in cellule che non si trovano all’interno del ciclo cellulare e di inibire le vie pro-apoptotiche. Da questo ne deriva un ritardo della differenziazione nella cellula infetta creando così un ambiente adatto alla replicazione virale.

Le proteine virali codificate dai geni E5, E6 ed E7 deregolano i normali pathway di crescita cellulare: sono infatti capaci di disaccoppiare la proliferazione e la differenziazione cellulare favorendo la trasformazione neoplastica.

Per Papillomavirus animali vedere papillomavirus bovino (BPV), papillomavirus orale del cane (COPV), papillomavirus del coniglio (CRPV o virus del papilloma di Shope).

Filogenesi

DominioAcytota
GruppoGruppo I (virus a dsDNA)
FamigliaPapillomaviridae
GenerePapillomavirus
SpecieHuman papillomavirus

Un tempo i papillomavirus facevano parte della Famiglia Papovaviridae che è stata successivamente suddivisa in due famiglie distinte: Papillomaviridae e Polyomaviridae.

Morfologia strutturale

I Papillomavirus sono un genere di virus costituiti da capside icosaedrico formato da 72 capsomeri e resistente all’inattivazione; sono sprovvisti di envelope (involucro pericapsidico) e misurano circa 55nm di diametro.

I capsomeri sono a loro volta formati dalle proteine capsidiche maggiore (L1) e minore (L2) che si assemblano in esameri e pentameri. Il genoma di HPV è costituito da una doppia elica di DNA in forma circolare approssimativamente di 8kb.

Struttura del genoma virale ed early genes di HPV

Il DNA di HPV può essere grossolanamente suddiviso in 3 regioni (Figura 1):

LCR (locus control region): elemento che promuove l’espressione di geni distali grazie al reclutamento di complessi trascrizionali, coattivatori ed altri elementi.

Early region: contiene le open reading frames (ORFs) che codificano per proteine non strutturali indicate con la lettera E (early) da 1 a 8. Queste proteine regolano il ciclo virale e intervengono modificando anche il ciclo replicativo cellulare.

Late region: contiene due geni tardivi codificanti per la proteina capsidica maggiore (L1) e per la proteina capsidica minore (L2), proteine strutturali necessarie alla formazione del virione maturo. L2 in particolare è capace di legare il DNA di HPV e permetterne così l’incapsidamento.

In particolare:

E1: lega il DNA virale a livello della sequenza ori (origine di replicazione) e grazie all’aiuto della proteina E2 forma un’elicasi esamerica. É inoltre capace di reclutare numerose proteine cellulari implicate nella replicazione, come la DNApolimerasi alfa e RPA (replication protein A). Permette il mantenimento in forma episomiale del genoma virale.

E2: è il principale regolatore trascrizionale di HPV, può promuovere o arrestare la trascrizione di geni virali. Occasionalmente la sua funzione può essere persa per via di mutazioni o a causa dell’integrazione del genoma virale con quello cellulare con conseguente inattivazione del gene E2. Queste mutazioni conducono ad un arresto della repressione trascrizionale esercitata da E2 nei confronti di E6 e E7, questi ultimi saranno quindi espressi in grande quantità contribuendo alla progressione maligna in caso di HPV ad alto rischio.

E3: funzione non conosciuta, non pienamente compresa.

E4: espressa nelle fasi tardive dell’infezione, la ritroviamo fortemente espressa negli strati epiteliali medi e superficiali ed è importante ai fini della maturazione e dell’amplificazione virale. Contiene nella sua porzione N-terminale un gruppo leucinico capace di legare le cheratine appartenenti al citoscheletro intracitoplasmatico: disgregando la struttura cellulare promuove il rilascio dei virioni maturi.

E5: classificata come proteina oncogena in quanto incrementa la crescita cellulare tramite attivazione e stabilizzazione del recettore per il fattore di crescita epidermico (EGF-R). Sembra avere un ruolo anche nella down-regolazione di MHC I e II aumentando così la capacità di evasione dal sistema immunitario, soprattutto negli HPV ad alto rischio.

E6: lega p53 (oncosoppressore, regola il ciclo cellulare) e ne favorisce l’ubiquitinazione e la conseguente disgregazione via proteasoma. Interferisce quindi con i meccanismi di riparazione del DNA e con l’innesco dell’apoptosi. É inoltre capace di inattivare le telomerasi.

E7: lega p105 (oncosoppressore, anche detta pRb o proteina del gene Retinoblastoma) inattivandola, questo impedisce il blocco del ciclo cellulare e la riparazione del DNA della cellula ospite.

E8: funzione ancora sconosciuta, non pienamente compresa.

Rappresentazione schematica dei geni di HPV.
Figura 1 – Schematizzazione del genoma di HPV

Patogenesi

L’infezione inizia a livello dello strato basale epiteliale in cui HPV giunge grazie a piccole lacerazioni, anche microscopiche, di cute e mucose.

Il ciclo di replicazione di HPV è correlato strettamente con il ciclo vitale delle cellule epiteliali: la maturazione del virus va infatti di pari passo con la differenziazione delle cellule che infetta. Il virus replica e si assembla nel nucleo della cellula ospite.

La proteina capsidica maggiore (L1) lega proteoglicani eparinici, integrina alfa 6 e altri recettori cellulari che ritroviamo a livello basale. Da queste interazioni derivano cambiamenti conformazionali del capside che portano all’esposizione e al successivo clivaggio in posizione N-terminale della proteina capsidica minore (L2), questo passaggio rende più accessibile il sito di legame di L1 e promuove così l’entrata definitiva del virus nella cellula.

A livello dello strato basale dell’epitelio il genoma del virus è mantenuto in forma plasmidica o episomiale, l’espressione di geni virali è minima e la replicazione di HPV avviene solamente quando anche la cellula si divide. Questa fase di scarsa attività virale viene sfruttata per eludere il sistema immunitario dell’ospite (Figura 2).

Geni di HPV espressi in correlazione alla maturazione degli strati epiteliali.
Figura 2 – espressione del genoma di HPV in relazione agli strati epiteliali

Quando la cellula infettata inizia a differenziarsi, a livello dello strato spinoso, assistiamo ad una forte up-regolazione dell’espressione e della replicazione del DNA di HPV. Questo processo permette la produzione di migliaia di copie di DNA virale per cellula.

Nello strato granuloso inizia anche l’espressione dei late genes codificanti le proteine capsidiche che permetteranno l’assemblaggio del virus.
L’attiva proliferazione va a determinare ipercheratosi e ispessimento delle cellule dello strato basale, spinoso e granuloso, caratteristica istologica tipica di verruche, condilomi o papillomi, riscontrabile al microscopio.

In fine a livello dello strato corneo, il più superficiale, avviene il rilascio dei virioni maturi nell’ambiente esterno.

Meccanismi di trasformazione neoplastica

Integrazione virale

Quando avviene la produzione di virioni il processo è associato a pattern molecolari per la sintesi di cromosomi virali, dsRNAs e capsidi vuoti che triggerano la risposta immunitaria innata e i meccanismi di riparazione del DNA cellulare. L’attivazione dei toll like receptor e il segnale interferonico indotto dal virus amplificano la risposta immune che si renderà capace di uccidere le cellule infettate da HPV.

Se invece avviene l’integrazione del DNA virale con quello cellulare, il virus perde la capacità di replicare e formare virioni maturi: questa condizione è chiamata pseudo latenza e sembrerebbe essere il primum movens della trasformazione neoplastica. La rottura del genoma circolare a livello dei geni E1 ed E2 e la successiva integrazione col DNA cellulare causa l’inattivazione di tali geni, impedendo così la replicazione virale senza però interrompere l’espressione di altri geni come E5, E6 ed E7.

Di notabile importanza è il fatto che il DNA di HPV possa integrarsi nei cromosomi umani in prossimità di siti di fragilità vicino a geni come VMP1, PVRL1, CHERP, CEACAM5, AHR e MRF 2. Queste integrazioni sono state ritrovate in un numero significativo di lesioni genitali di alto grado ma non di basso grado, indicando come questo sia un evento critico e tardivo della progressione tumorale.

L’integrazione comporta delezioni e/o mutazioni di geni virali e una generica diminuzione del mantenimento dell’integrità genomica: è possibile infatti notare numerose anormalità mitotiche come ponti di anafase (anaphase bridges), alterazioni grossolane dei cromosomi e mitosi a polarità multipla, quest’ultime caratteristiche di HPV ad alto rischio associati a lesioni neoplastiche cervicali.

Deregolazione dei meccanismi apoptotici

I dati suggeriscono che le oncoproteine di HPV ad alto rischio, E5, E6, E7, abbiano un ruolo anche nell’inibizione dei recettori per il segnale di morte cellulare, infatti guidano la cellula infetta verso la sopravvivenza, facilitano il ciclo replicativo e lo spargersi della progenie virale.

Carcinomi cervicali positivi a HPV mostrano un’espressione alterata di numerose caspasi e la downregolazione dell’espressione di Fas guidando la cellula verso la soppressione dei meccanismi pro-apoptotici.

Meccanismi di splicing

Le proteine ricche in serina/arginina (SR proteins) sono una famiglia di regolatori dello splicing altamente conservate; queste vengono utilizzate da molti virus, HPV compreso, per incrementare il proprio proteoma partendo da un numero limitato di geni. E2 up regola specificatamente l’espressione delle SR proteins SF2/ASF (splicing factor 2/alternative splicing factor), SRp20 e SC35 nelle cellule epiteliali infette. Sf2/asf è un protoncogene che troviamo fortemente espresso in numerosi tumori non necessariamente causati da virus. Infatti le SR proteins potrebbero rivelarsi un ottimo target sia in terapie antivirali contro HPV sia in terapie antitumorali.

Ruolo del sistema immunitario dell’ospite

Va ricordato come l’assetto immunologico del paziente giochi un ruolo fondamentale nello sviluppo di neoplasie HPV correlate. I linfociti T sono capaci di riconoscere ed eliminare cellule infette e cellule neoplastiche tramite il riconoscimento di antigeni esposti sul complesso maggiore di istocompatibilità di tipo I (MHC I).

Da queste considerazioni si intuisce facilmente come una deficienza di linfociti T, a causa di condizioni congenite o acquisite, possa facilitare sia la latenza dell’infezione da HPV sia l’insorgenza di neoplasie ad esso correlate.

Cancer stem cell model

É un modello di organizzazione tumorale ordinato gerarchicamente in cui ritroviamo la cellula tumorale staminale (CSC) al vertice di una ipotetica piramide. Le CSC sono un sottogruppo di cellule tumorigeniche che possiedono la capacità di autorinnovarsi a lungo termine e di generare tutte le altre cellule tumorali responsabili della crescita della massa neoplastica.
Sono anche implicate nella resistenza a farmaci antitumorali e nella disseminazione metastatica di diverse tipologie di neoplasie. La riprogrammazione cellulare che avviene ad opera di virus oncogenici potrebbe promuovere proprio la formazione di queste CSCs.

In supporto a questa ipotesi uno studio ha mostrato che il potenziale invasivo e metastatico del carcinoma a cellule squamose della cervice è correlato a geni associati alla staminalità, avvalorando l’idea che gli HPV ad alto rischio possano indurre il fenotipo CSC nelle cellule della zona di transizione dell’epitelio cervicale.

È stato dimostrato che l’espressione di E6 e E7 induce una riprogrammazione epigenetica nei cheratinociti umani tramite modificazioni della struttura della cromatina. Queste modificazioni guidano la cellula verso un assetto di tipo staminale e quindi verso la trasformazione neoplastica (Figura 3).

Modello della cellula staminale tumorale applicabile ai meccanismi di cancerogenesi indotti da HPV.
Figura 3 – modello gerarchico della cellula staminale tumorale

Patologie associate ad HPV

HPV causa un vasto spettro di patologie infettando cellule dell’epitelio squamoso della cute (verruche) oppure delle mucose (papillomi genitali, orali e congiuntivali). Va ricordato come la benignità o malignità delle manifestazioni sia associata al tipo di HPV che infetta, se ad alto o a basso rischio.

– Verruche comuni:
proliferazione benigna della cute con tendenza alla regressione.
L’incubazione è di circa 2-5 mesi e la localizzazione tipica è sulle mani e sulla pianta dei piedi. É possibile ritrovarle anche a livello del volto e sono causate principalmente da tipi comuni di HPV (1-4).

Verruche della regione genitale:
prendono anche il nome di condilomi acuminati. Il 90% di questi è causato da HPV-6 e HPV-11, tendono a recidivare ma raramente subiscono trasformazione maligna in soggetti altrimenti sani. Le verruche anali, peniene, vulvari e perineali possono divenire maligne se causate da HPV oncogeni ad alto rischio.

– Tumori del distretto testa-collo:
I papillomi orali singoli e papillomi laringei sono rispettivamente i tumori benigni più frequenti della cavità orale e della laringe, raramente recidivano dopo intervento chirurgico ed occasionalmente possono estendersi alla trachea. Fino all’80% dei carcinomi orofaringei e laringei contiene genoma di HPV ad alto rischio questo a riconferma del fatto che la malignità della lesione è strettamente correlata al tipo di HPV.

– Tumori della cervice:
a metà del XIX° secolo il medico veronese Domenico Rigoni Stern osservò come il tumore del collo dell’utero, tumore molto frequente nelle donne, fosse invece rarissimo nelle suore di clausura, arrivando ad ipotizzarne l’associazione con l’attività sessuale. Solo nel 1982 Harold Zur Hausen, Nobel per la medicina nel 2008 (Figura 4), riuscì a isolare il DNA di HPV da cellule tumorali della cervice, identificando in maniera definitiva il papillomavirus umano come agente causativo del tumore.

La prima alterazione neoplastica osservabile al microscopio è la displasia di cellule localizzate a livello della giunzione squamocolonnare della cervice. Il 40-70% delle displasie lievi regredisce spontaneamente ma può capitare che progredisca fino a manifestarsi come carcinoma in situ, in un periodo di tempo variabile tra 1 e 5 anni.

– Ruolo potenziale di HPV nel tumore mammario:
Numerosi studi hanno messo in evidenza la presenza di DNA appartenente ad HPV in carcinomi mammari. Sono stati analizzati campioni mammari tumorali e campioni normali: è stato notato come nei campioni neoplastici il ritrovamento di DNA HPV era significativamente più alto (dal 35 al 51%) rispetto ai campioni sani (15%). Serviranno ulteriori ricerche per confermare la patogenesi virale di questa porzione di tumori mammari.

Harold Zur Hausen fu il primo ad isolare genoma di papillomavirus da carcinoma della cervice uterina.
Figura 4 – Harold Zur Hausen, Nobel per la medicina 2008.

Metodi di identificazione

È possibile diagnosticare una verruca sulla base dell’aspetto istologico caratteristico al microscopio ottico: un’iperplasia delle cellule spinose e ipercheratosi.

L’infezione da HPV può essere rilevata in strisci colorati secondo il metodo di Papanicolaou (Pap-test) in cui si evidenziano gruppi di cellule epiteliali arrotondate, con nucleo ipercromatico e un alone chiaro causato dalla vacuolizzazione citoplasmatica perinucleare. Queste cellule prendono il nome di coilociti.

Il gold standard per la diagnosi e la tipizzazione dell’infezione da HPV è rappresentato dall’utilizzo di sonde molecolari a DNA, dalla reazione polimerasica a catena (PCR) e dalla real time PCR (rt-PCR) su tamponi cervicali e campioni istologici. I papillomavirus non crescono in colture cellulari e la ricerca di anticorpi da prelievi ematici è utilizzata solo a scopo di ricerca.

Il THINPrep, citologia in fase liquida

Si può definire come l’evoluzione del Pap-test classico. Il prelievo di cellule avviene sempre tramite tampone, questo però non viene direttamente strisciato su vetrino bensì introdotto in una fiala contenente un liquido di conservazione.

In laboratorio verranno separate meccanicamente le cellule dal materiale non necessario ma inevitabilmente presente sul tampone. Verrà quindi allestito il vetrino privo di materiale interferente come sangue, muco e altri detriti cellulari, risultando così più leggibile e meno soggetto ad artefatti. Le cellule rimanenti vengono conservate e laddove richiesto si può procedere con una ricerca di acidi nucleici virali sullo stesso campione (Figura 5).

I vantaggi del THINPrep sono duplici: l’allestimento del vetrino più “pulito” e la possibilità di svolgere esami aggiuntivi senza far sottoporre il paziente ad ulteriori prelievi.

THINPrep e coilociti.
Figura 5 – THINPrep a sinistra e coilocitosi con colorazione di Papanicolaou a destra

Terapia

La profilassi è rappresentata dall’immunizzazione con vaccino, questo può essere:

  • Bivalente (Cervarix, HPV 16 – 18)
  • Tetravalente (Gardasil, HPV 6 – 11 – 16 – 18)
  • Nonavalente (Gardasil 9, HPV 6 – 11 – 16 – 18 – 31 – 33 – 45 – 52 – 58)

La proteina capsidica maggiore L1, antigene vaccinale, possiede la capacità di auto assemblarsi in virus like particles (VLPs). Questo meccanismo è infatti sfruttato per la produzione di proteine ricombinanti ai fini dell’allestimento del vaccino.

Il vaccino è raccomandato in bambini e bambine intorno agli 11-12 anni o comunque prima che avvengano dei rapporti sessuali. Il vaccino non è da considerarsi una sostituzione dei test di screening poiché non copre tutti i tipi di HPV conosciuti e anche le donne vaccinate devono continuare a sottoporvisi.

In una buona parte dei casi le verruche regrediscono spontaneamente in un tempo variabile da diversi mesi a anni, spesso però vengono rimosse perchè dolorose, contagiose ed esteticamente invalidanti. Possono essere rimosse tramite crioterapia chirurgica o metodi chimici (10-25% podofilline in soluzione). La rimozione chirurgica escissionale è consigliata in caso di infezioni mucosali con presenza di papillomi.

Possono essere utilizzati degli stimolatori della risposta immunitaria come l’Imiquimod e interferone per favorire una guarigione più rapida. Cidofovir tramite somministrazione topica o intralesionale permette di uccidere selettivamente le cellule infettate da HPV. Questo farmaco antivirale induce apoptosi tramite l’inibizione della DNA polimerasi della cellula ospite.

Per quanto riguarda i tumori maligni causati da HPV si utilizza un regime combinato di chirurgia, chemioterapia e radioterapia studiato appositamente sulle caratteristiche del paziente affetto, sulla localizzazione e tipo di lesione neoplastica riscontrata.

Giulia Pucci

Fonti

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