Tecniche di colture cellulari per l’isolamento di un particolare virus ambientale: l’Adenovirus

Indice di inquinamento virale ambientale

I virus sono piccoli agenti infettivi che utilizzano i macchinari biosintetici delle cellule infettate per riprodursi; sono detti infatti parassiti intracellulari obbligati (non possono moltiplicarsi all’esterno di una cellula vivente). I virus riconoscono le cellule da infettare, liberano al loro interno il loro patrimonio genetico (DNA o RNA) e ne assumono il controllo. Una volta infettata la cellula, il virus può distruggerla e far rilasciare la progenie virale (effetto citotossico diretto) o può indirizzare il sistema di difesa dell’ospite verso la cellula infettata che viene così distrutta (effetto citotossico indiretto).

La diagnosi delle infezioni virali spesso è possibile solo con indagini di laboratorio perché molti virus presentano segni e sintomi sovrapponibili e le co-infezioni sono molto frequenti. I test finora disponibili, soprattutto per l’identificazione di alcuni virus, presentano, però, o scarsa sensibilità, o tempi di refertazione lunghi, o identificano uno o pochi virus contemporaneamente.

È evidente che una rapida identificazione dell’agente virale che causa la patologia permette di:

• stabilire prontamente una terapia adeguata;
• identificare l’agente eziologico responsabile della sindrome e prevederne le complicazioni;
• accorciare i tempi di ospedalizzazione o di trattamento;
• risparmiare risorse economiche.

La presenza di virus nelle matrici ambientali rappresenta un fattore di rischio importante per quanto riguarda la sanità pubblica. Focalizzandosi sui virus trasmessi attraverso l’acqua si può notare che sono molto eterogenei, più di 140 diverse famiglie. Le epidemie di origine idrica, o tecnicamente “waterborne diseases” sono, però, sicuramente sottostimate per la mancanza di adeguati programmi di sorveglianza epidemiologica.
Mentre negli ultimi anni gli Adenovirus ed i Norovirus stanno destando un crescente interesse in campo ambientale per la comunità europea che ha di recente finanziato il progetto VIROBATHE per una stima della diffusione di questi virus nelle acque di balneazione, in Italia esistono scarse informazioni sulla epidemiologia delle infezioni da Adenovirus: ad esempio nel D.Lgs. 116/2008 la ricerca di enterovirus in acque di balneazione non è in alcun modo normata.

Processo multistep per la ricerca di virus in colture e matrici idriche

Per la ricerca di virus in matrici idriche si procede nel modo seguente:

• Prelievo del campione (100-1000L);
• Concentrazione primaria (circa0.5-1L): adsorbimento/eluizione, ultrafiltrazione;
• Concentrazione secondaria (circa 10mL): flocculazione organica, PEG, ultracentrifugazione;
• Identificazione: metodi colturali, metodi molecolari;
• Quantificazione: titolazione su monostrati cellulari o Real-Time PCR

Adenovirus

La famiglia degli Adenovirus (Adenoviridae) è stata identificata come agente patogeno dell’uomo nel 1953. Comprende circa 100 diversi sierotipi, di cui circa la metà in grado di attaccare l’uomo e sono virus a DNA (dsDNA) ad elevato potere patogeno e ampiamente diffusi nell’intera popolazione mondiale.

Questi sono virus nudi, hanno una classica simmetria icosaedrica ed hanno i capsomeri (unità strutturale del capside) dati da esameri e pentameri che occupano i vertici dell’icosaedro. All’apice di ogni vertice è possibile osservare la fibra che è tossica ed è ciò che media l’ingresso del virus per endocitosi.

Questi sono virus che si possono trasmettere per via respiratoria, contatti diretti oppure per via alimentare. Le manifestazioni cliniche di infezione sono varie e dipendono dal sierotipo con cui si viene a contatto, ciascuno dei quali si va a localizzare in uno specifico distretto dell’organismo. Sono quindi in grado di causare numerosi disturbi di varia natura e un individuo che entra in contatto con uno specifico sierotipo rimane comunque successivamente soggetto ad infezioni provocate da altri virus della stessa famiglia.

Nella maggior parte dei casi i sintomi sono quelli tipici delle malattie da raffreddamento (infezioni respiratorie), ma altri ceppi possono essere responsabili di altre malattie come gastroenterite, congiuntivite, cistite e, meno frequentemente, infezioni neurologiche. I neonati e i pazienti con sistema immunitario indebolito sono i soggetti a più alto rischio di sviluppare complicazioni, oltre a rimanere contagiosi per diverse settimane o più.

La peculiarità di Adenovirus è quella di essere un patogeno persistente in matrici idriche, dove vi può rimanere fino ad un mese alla temperatura di 20°C. Inoltre, persiste al cloro ed ha un’elevata infettività (10-10^2 particelle).

Non esiste, ad oggi, una terapia specifica per infezioni da Adenovirus: sono disponibili vaccini ma è una formulazione che è stata messa a punto non per uso civile, ed è quindi utilizzata dall’esercito militare. La terapia realmente utilizzata è sintomatica e di sostegno: si cerca di alleviare il fastidio dei singoli sintomi (ad esempio con antipiretici per abbassare la febbre, come la Tachipirina), ma in assenza di complicanze il riposo è sufficiente per permettere all’organismo di contrastare ed eradicare l’infezione. L’uso di antibiotici è tendenzialmente inutile, in quanto inefficaci contro i virus. La prevenzione è quindi più che altro comportamentale, attraverso piccoli accorgimenti igienici:

• Lavare le mani spesso con sapone ed acqua (eventualmente con disinfettanti a base alcolica);
• Coprire il naso e la bocca quando si tossisce/starnutisce;
• Evitare di toccare occhi, naso o bocca con le mani non lavate;
• Evitare un contatto stretto con persone malate.

Tecniche ed applicazioni in diagnostica virale

La diagnosi di laboratorio di un’infezione virale può essere eseguita tramite l’utilizzo di due approcci differenti:

Approccio diretto

Si basa sulla presenza nelle colture dell’agente virale e di alcuni suoi componenti. Si avvale di tecniche atte all’identificazione del virus direttamente nel campione clinico:

• Isolamento virale (coltivazione);
• Ricerca di particelle virali (microscopia);
• Ricerca di antigeni virus-specifichi (immunoenzimatica, IF);
• Ricerca di acidi nucleici virali (biologia molecolare).

Approccio indiretto

Consiste nella ricerca degli anticorpi specifici contro un determinato agente patogeno, e quindi riconducibile ad una diagnosi di tipo sierologico:

1. Ricerca di anticorpi vs antigeni virus-specifici.

Fino a pochi anni fa le tecniche erano limitate alle colture cellulari ed a un pannello ristretto di reazioni sierologiche. L’avvento di tecnologie molecolari molto sensibili (PCR e derivati) e di reagenti ottenuti tramite biotecnologia (es. sonde) ha consentito di effettuare la analisi in modo molto più veloce, affidabile ed in massima sicurezza. In particolare, la scelta e l’utilizzo dell’approccio diretto o indiretto dipende dal tipo di infezione, dallo stadio e dal tipo di virus.

Focus sulle colture cellulari

Le colture cellulari sono state sviluppate solo dopo l’avvento degli antibiotici e, in particolare, nel 1949, quando per la prima volta il Poliovirus è stato propagato con successo in colture di cellule eucariote. Enders, Weller e Robbins riscossero il premio Nobel nel 1954.

L’isolamento (coltivazione) virale è il “GOLD STANDARD” tra le metodiche utilizzate in diagnosi virologica perché, essendo i virus patogeni intracellulari obbligati, richiedono l’inoculazione in ospiti viventi adeguati, cioè sensibili e permissivi.

Ospiti per l’isolamento di:

• Fagi (batteriofagi o virus batterici): batteri
• Virus animali:
  • Animale (topo, coniglio, maiale)
  • Uova embrionate; ancora usata per la produzione di vaccini (influenzali)
  • Coltura cellulare animale: colture primarie, semicontinue, linee cellulari continue           

• Virus vegetali:
  • Pianta
  • Coltura cellulare vegetale

Approfondendo le colture cellulari animali si evince che, a seconda della tipologia cellulare scelta, si possono distinguere tre tipologie di coltura. Per preparare una coltura primaria si parte da un organo o da un tessuto ed è necessario ricorrere all’uso di mezzi meccanici o enzimatici per ottenere una sospensione omogenea di cellule. Quasi sempre viene preferita la digestione enzimatica, e la tripsina è l’enzima più frequentemente impiegato per la disgregazione perché è ben tollerata da molti tessuti e viene facilmente neutralizzata con il siero. Questa tecnica viene utilizzata quando si ha a disposizione una buona quantità di tessuto di partenza. Il successo di una coltura primaria è maggiore impiegando tessuti embrionali, nei quali è alto il numero di cellule indifferenziate e proliferanti e per i quali la minor quantità di tessuti fibrosi non rende necessario un lungo trattamento con l’enzima che potrebbe danneggiare le cellule isolate.

Le cellule crescono in opportuno terreno e devono essere preparate e mantenute in ambiente sterile per evitare crescite di batteri o funghi. Generalmente, il terreno di coltura per cellule contiene una soluzione di sali a concentrazioni fisiologiche, glucosio, aminoacidi, vitamine essenziali ed antibiotici; è tamponato a pH 7.2-7.4. Viene aggiunto siero fetale bovino al 10-20% per fornire integratori necessari per l’accrescimento delle cellule.

La composizione del terreno varia a seconda del tipo di cellula e vengono spesso aggiunti specifici fattori di crescita. Al momento dell’infezione il terreno di coltura viene sostituito con un terreno di mantenimento con circa 1.5% di siero che permette soltanto una scarsa moltiplicazione delle cellule.

Quando si procede con la coltura cellulare e la successiva semina ci sono passaggi specifici da effettuare:

• Trattamento del campione per limitare la inattivazione virale (es. neutralizzazione pH; decontaminazione batterica tramite trattamento al cloroformio);
• Semina del campione;
• Mantenimento ed ispezione delle colture (33-37°C; 1-2 volte al giorno);
• Rilevazione di avvenuta replicazione virale;
  • formazione di placche (aree localizzate di lisi/distruzione cellulare);
  • comparsa di “effetti citopatici caratteristici” (CPE);
• Tipizzazione del virus.

Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari

Vantaggi

Consentono di isolare, tipizzare e conservare il virus; consentono di isolare virus non sospettabili o non conosciuti al momento dell’isolamento; risultano migliori delle tecniche di biologia molecolare per rilevare il grado di infettività perché con la biologia molecolare si può identificare la presenza (vedo ad esempio se c’è DNA virale) ma non l’infettività.

Svantaggi

Richiedono lunghi tempi di esecuzione; è necessario un sospetto eziologico, in quanto i virus presentano un tropismo cellulare; sono dipendenti dalla presenza di virus vitali nel campione (la refrigerazione inattiva i virus); si può verificare l’impossibilità di coltivare alcuni virus come ad esempio HPV (Papilloma virus); a volte sono poco specifiche se non associate ad altri test; risulta difficile mantenere la sterilità in quanto i mezzi di coltura sono molto “appetibili” per batteri, lieviti e funghi che possono facilmente inquinare le colture (fondamentale in tal senso fare tutte le manipolazioni in cappe a flusso laminare).

Conclusioni

In diagnostica, le colture cellulari come metodica di isolamento virale è una procedura standard e di largo impiego, il cui utilizzo non è limitato all’isolamento virale. Ad esempio, esse sono utilizzate per analizzare l’effetto di farmaci e verificare la mutagenicità e cancerogenicità delle sostanze, oppure, come mostrato dagli studi effettuati dall’università di Maastricht nel 2008, da una tecnica di coltura cellulare si è in grado di ottenere carne sintetica.

Ad oggi gli studi di biologia molecolare puntano a superare i problemi legati all’utilizzo di terreni contenenti siero con lo sviluppo di terreni serum- e protein-free per le colture cellulari. Ciò permette di ottenere terreni ottimizzati per diversi tipi di linee cellulari e garantiscono prestazioni di elevata qualità e riproducibilità a prezzi estremamente competitivi: questi nuovi sviluppi sembrerebbero capaci di superare i problemi legati ai rischi di contaminazione e alla rappresentazione poco vicina alla realtà data l’impossibilità, ad oggi, di riprodurre in vitro tutte le variabili che si manifestano in vivo.

Fonti

• M. La Placa, Principi di microbiologia medica; XIV edizione 2014; editore Edises.
• David Harper, Virus: applicazioni biotecnologiche e strategie di controllo; Trad. di A. Amendola, E. Pariani 2013; editore Zanichelli.
• Henry’s, Diagnosi clinica e metodi di laboratorio; volume2, 21esima edizione; editore Antonio Delfino.
• https://www.camera.it/parlam/leggi/deleghe/08116dl.htm
• https://www.arpae.it/cms3/documenti/_cerca_doc/ecoscienza2014_3/LaRosa_et_al_es2014_3.pdf