CRISPR – CAs9 il taglia e cuci 4.0: le biotecnologie per la lotta contro le malattie genetiche

Le biotecnologie di “genome editing” come il CRISPR-Cas9 sono il taglia e cuci in versione 4.0 più utilizzato negli ultimi quindici anni. Queste biotecnologie sono importanti perché modificano le sequenze di DNA quando il patrimonio genetico è la causa di processi patologici come le malattie genetiche, ad esempio la Sindrome di San Filippo, (1). Grazie alle tecniche come CRISPR-Cas9 si spera di poter curare malattie genetiche in un futuro non troppo lontano.

Il CRISPR-Cas9 è una tecnica di genome editing: in cosa consiste? 

Negli ultimi decenni e biotecnologie di genome editing sono state ampiamente utilizzate. Vediamo alcuni esempi. Le nucleasi Zinc Finger (ZFN) sono proteine artificiali costituite da due porzioni distinte. Queste proteine sono in grado di riconoscere la sequenza bersaglio e tagliare il DNA, mettendo in moto i normali meccanismi riparativi della cellula. Oltre alle ZFN, ci sono le proteine Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN), enzimi di restrizione ingegnerizzati per legarsi a qualsiasi sequenza di DNA desiderata. Vengono introdotti nelle cellule per modificare i geni target. Infine, la tecnica di genome editing che ha ampiamente superato le altre per progettazione e costi è il CRISPR-Cas9. Alla luce di questi vantaggi economici tempo e costi, cerchiamo di descrivere nei paragrafi successivi le caratteristiche fondamentali.

Che cosa vuol dire CRISPR – Cas9 ?

CRISPR, si pronuncia CRISPER, corrisponde all’acronimo inglese per Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Vuol dire brevi ripetizioni palindromiche, meglio sequenze di DNA leggibili in entrambi i sensi e intervallate regolarmente in cluster. Ovvero, piccoli gruppi di sequenza. Nel sistema CRISPR-Cas9 l’RNA a guida singola (sgRNA) si lega alle nucleasi formando un complesso DNA specifico. Conseguentemente si prevede un taglio e il seguente riarrangiamento del gene che può dare origine ad un knock-out (KO) genico, quindi il silenziamento del gene bersaglio.

Quale specie utilizza la nucleasi Cas9?

Cosa serve la Cas9 allo Streptococcus pyogenes?

Cerchiamo di capire perchè i batteri utilizzano la Cas9 e che ruolo ha questa proteina nella vita batterica. Esattamente come succede alle specie animali, anche i batteri sono suscettibili ai virus, i quali tornano ad essere ospiti non graditi. I virus batterici, noti come batteriofagi (fagi), possono proliferare producendo particelle virali e lisando la cellula batterica (5). Possono anche integrarsi nel genoma batterico e replicarsi promuovendo il trasferimento genico tra batteri. Questo è noto come Horizontal Gene Transfer (HGT), ovvero il trasferimento di DNA tra individui della stessa specie. La specie Streptococcus pyogenes utilizza la Cas9 per riconoscere le sequenze target del virus bersaglio. In tal modo, disattiva il meccanismo di infezione silenziando i geni del fago.

Qualcosa in più sul meccanismo di difesa?

Vediamo qualcosa in più sul meccanismo d’azione alla base del CRISPR-Cas9. Il sistema di resistenza agli attacchi dei patogeni virali è risultato estremamente interessante non solo per gli stessi “cocchi” a cui l’evoluzione ha permesso di sopravvivere con un sistema soddisfacente. Questa strategia ha suscitato l’interesse dei ricercatori, i quali hanno studiato il meccanismo di difesa e l’hanno introdotto in molteplici campi di applicazione (1,5,6), fino alle terapie geniche per la cura di malattie rare. Il sistema di difesa batterico è stato pubblicato su Nature nel 2012 per la notevole collaborazione di due scienziate Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna, entrambe premio Nobel per la Chimica nel 2020.

Come avviene il taglia e cuci 4.0 del CRISPR-Cas9?  

Approfondiamo i passaggi della Cas9 per capire come avviene la modifica al sito bersaglio. La versatilità del sistema ha permesso alle bioscienze di applicare il CRISPR-Cas9 per editare (modificare) i geni bersaglio. Questo avviene sia per sistemi modello che in ricerca applicata (4,6,7). Oggi l’editing è finalizzato al miglioramento di problemi reali, spesso diversissimi tra loro, dalle malattie rare al miglioramento genetico per la resistenza ai patogeni nelle colture come riso e mais.

In Figura 3 si descrive il meccanismo del CRISPR-Cas9 in quattro step. Nel primo passaggio si identifica la sequenza di DNA da modificare cercando i siti migliori di taglio sintetizzando un costrutto specifico con gRNA (RNA guida). Il secondo step prevede l’appaiamento sito specifico tra i gRNA (complesso Cas9-gRNA-DNA). Successivamente il terzo passaggio comporta il taglio del DNA nelle vicinanze dei siti PAM. Infine, come ultimo step si prevede il blocco del gene attraverso tre possibili opzioni quali mutazione, delezione o inserzione.

Come può il CRISPR essere così versatile nella sua applicazione?

La versatilità del CRISPR risiede nell’universalità del codice genetico. Questa è la prima caratteristica che permette di leggere e scrivere la biologia molecolare nella stessa lingua in tutti i viventi. È sempre e solo il codice genetico che fornisce le informazioni fondamentali per leggere ed esprimere una proteina. Resta l’unico mezzo per introdurre e modificare gli oggetti di studio, i geni. Il secondo fattore che permette al CRISPR-Cas9 di essere così versatile è l’abbattimento dei costi di applicazione e la semplicità di design molecolare. Questo è unito all’impegno e alle capacità dei ricercatori. Gli esperti adottano questa tecnica per individuare le sequenze bersaglio e determinare un KO bloccando l’espressione del gene che causa il disagio. Ecco che il taglia e cuci 4.0 del CRISPR-Cas9 può permettere di modificare un carattere ereditario ampliando un nuovo ambito di cura per le malattie rare.

Bibliogafia

1. doi:10.2147/TACG.S57672
2. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.7b00057
3. doi: 10.3390/diseases5010006
4. doi: 10.3389/fpls.2018.0124
5. doi: 10.1080/15476286.2019.1582974
6. doi: 10.1007/s00299-019-02378-1
7. doi 10.1007/s00299-019-02378-1.

Sitografia

https://www.umassmed.edu/