Sakazakii Chromogenic Agar

Utilizzo

Sakazakii Chromogenic Agar (Fig.1), noto anche come “EISA“, è un terreno di coltura solido, selettivo e differenziale per l’isolamento di Cronobacter sakazakii (E. sakazakii) in campioni di latte/latticini, secondo quanto previsto dalla norma ISO/TS 22964 e IDF/RM 210.

Sakazakii Chromogenic Agar
Figura 1 – Sakazakii Chromogenic Agar. [Fonte: Bio-Rad Laboratories]

Cronobacter Sakazakii

Cronobacter sakazakii (Fig.2), comunemente noto come Enterobacter sakazakii, è un patogeno opportunista Gram negativo, capace di sopravvivere in ambienti piuttosto secchi.
Le infezioni da C. sakazakii possono indurre la nascita prematura dei bambini (che sono i più colpiti, con tasso di mortalità compreso tra 40-80%), batteriemie, meningiti ed enterocolite necrotizzante.

Cronobacter sakazakii
Figura 2 – Cronobacter sakazakii. [Fonte: blog.microbiologics.com]

La prima forma di Cronobacter mai isolata è stata ritrovata nel 1950 all’interno di un prodotto alimentare per bambini, ovvero, il latte in polvere. Nel 1980, John J. Farmer III propose di chiamarlo E. sakazakii in onore del microbiologo giapponese Riichi Sakazaki, tuttavia, una decina di anni dopo, fu istituito il genere Cronobacter (comprendente più biogruppi) da “Cronos”, il titano della mitologia greca che divorava i bambini appena nati (Vid.1).

La pericolosità di questo batterio (Vid.2) risiede nella sua spiccata capacità di sopravvivere in ambienti fortemente disidratati, come nel latte in polvere. Infatti, è stato spesso responsabile di epidemie infettive di neonati con forti sintomi gastrointestinali aspecifici, talvolta associati a sepsi e meningiti letali.
Si tratta principalmente di un microrganismo opportunista, capace di recare danno soprattutto a soggetti fragili, come i neonati, che non hanno ancora sviluppato un solido sistema immunitario.
Negli adulti i sintomi sono generalmente lievi/moderati e gli antibiotici orali sono ampiamente sufficienti per debellare l’infezione.

Composizione e preparazione

La composizione del terreno di coltura è riportata in Tabella 1:

IngredienteQuantità (g/l)
Peptone di caseina pancreatica7,000
Estratto di lievito3,000
Cloruro di sodio5,000
Desossicolato di sodio0,600
5-Br-4-Cl-3-indolil-alfa-D-glucopiranosio0,150
Cristal violetto0,002
Agar15,000
Tabella 1 – Formula del terreno di coltura. [Fonte: Scharlau – Scheda Tecnica]

La formula del terreno di coltura può essere modificata a seconda dei criteri di performance che si vogliono ottenere, l’importante è che il suo pH finale resti di 7 a 25°C.

Per la preparazione è necessario seguire i passaggi elencati:

  • Sospendere 30,75 g di polvere in 1 litro di acqua distillata.
  • Portare ad ebollizione, mescolando, fino al completo scioglimento delle polveri.
  • Autoclavare per 15 minuti a 121°C.

Metodo

I dettagli del metodo di coltura possono essere ritrovati nella norma ISO/TS 22964:2006 e nel IDF/RM 210:2006.
Riassumendo, il metodo prevede di seminare il campione in un brodo di pre-arricchimento che va incubato a 37°C, per poi trasferirlo in un brodo più selettivo contenete a lauril-triptosio e vancomicina a 44°C. Al termine di questo processo, il campione può essere seminato sul Sakazakii Chromogenic Agar e incubato a 44°C.

Risultati attesi

Come detto pocanzi, Cronobacter spp. può causare gravi problemi di salute (meningiti, enterocoliti e sepsi) nei neonati o nei bambini molto piccoli. Per questo, e per ridurre il rischio di infettarsi tramite l’ingestione di alimenti specifici come il latte, sono stati sviluppati piani di controllo per i latticini (ISO e FIL-IDF) che prevedono la rilevazione del patogeno tramite l’utilizzo del Sakazakii Chromogenic Agar.

C. sakazakii, infatti, produce l’enzima alfa-glucosidasi che idrolizza il 5-Bromo-4-Cloro-3-indolil-alfa-D-glucopiranosio del terreno con reazione cromogena.
Il risultato è dato dalla comparsa di colonie blu/verdi sul substrato, diverse dalle altre Enterobacteriaceae che potrebbero svilupparsi sul terreno.
Inoltre, il desossicolato di sodio e il cristal violetto inibiscono lo sviluppo dei batteri Gram positivi.

Immagini

I risultati della crescita di Cronobacter spp. sul terreno sono visibili in Fig. 3 e 4:

Sakazakii Chromogenic Agar con colonie blu-verdi date dall'attività dell'enzima alfa-glucosidasi del batterio
Figura 3 – Sakazakii Chromogenic Agar con colonie blu-verdi date dall’attività dell’enzima alfa-glucosidasi del batterio. [Fonte: Thermo Fisher Scientific]
Colonie di Cronobacter spp. sul terreno di coltura cromogeno; il loro tipico colore è blu-verde
Figura 4 – Colonie di Cronobacter spp. sul terreno di coltura cromogeno; il loro tipico colore è blu-verde. [Fonte: cit.vfu.cz]

Limitazioni

Il genere Cronobacter comprende attualmente diverse specie di microrganismi che possono svilupparsi con aspetto differente sul terreno: per esempio, alcune non sono in grado di crescere a temperature di 44°C.
Per l’identificazione certa, quindi, è sempre raccomandabile affiancare ai terreni analisi di tipo biochimico o sierologico di conferma e supporto.

Controllo qualità

Per un controllo qualità del terreno bisogna incubarlo a 44°C per 24 h, i microrganismi utilizzabili sono riportati nella Tabella 2:

MicrorganismoCrescitaAspetto
Cronobacter sakazakii ATCC®
29544
BuonaColonie blu/verdi con 1-2 mm di diametro
Cronobacter muytjensii ATCC®
51329
BuonaColonie blu/verdi con 1-2 mm di diametro
Escherichia coli ATCC®
25922
Da scarsa a buonaColonie giallo paglierino con 0,25-1 mm di diametro
Staphylococcus aureus ATCC®
25923
Da debole a scarsaInibite o assenti
Enterobacter aerogenes ATCC®
13048
BuonaColonie incolori
Tabella 2 – Aspetto e crescita dei microrganismi sfruttabili per il controllo qualità del terreno. [Fonte: Scharlau – Scheda Tecnica]

Fonti

Crediti immagini
Crediti tabelle
Filmati e approfondimenti consigliati

Video 1Crono – il Re dei Titani:

Video 2Cronobacter and Your Health:

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