Il RAPID’L.mono Agar, sviluppato dalla Bio-Rad Laboratories, è un terreno di coltura batterico selettivo per Listeria monocytogenes, che permette di rilevare e contare la presenza di questa specie in sole 24 ore. Questa distinzione avviene attraverso una reazione cromogenica, in cui il substrato interagisce con un enzima rilasciato da Listeria spp., rispondendo con un cambiamento cromatico che rende le colonie visibili e facilmente identificabili.
Utilizzo
I metodi tradizionali possono essere sostituiti da questo terreno di coltura batterico; i primi infatti, non sono efficaci per fermare i focolai delle specie Listeria, a causa della tardiva identificazione, portando grandi disagi alla sicurezza pubblica e all’industria alimentare che obbligherebbe a ritirare dei prodotti contaminati dai mercati e di interrompere le linee di produzione, per effettuare pulizie e sanificazioni. Al contrario, questo terreno di coltura cromogenico selettivo è capace di diagnosticare precocemente le contaminazioni dei campioni, prima ancora che gli alimenti vengano proposti al commercio.
L’insieme delle operazioni che coinvolgono la preparazione del terreno di coltura disidratato e del del terreno di coltura in flacone RAPID’L.mono Agar, verranno eseguite nel rispetto delle norme EN ISO 7128, insite nelle certificazioni del sistema di NF validation, rilasciate dall’organizzazione AFNOR.
Composizione del terreno
Si riporta la composizione del terreno di coltura selettivo RAPID’L.mono Agar:
- Peptoni – 30g;
- Estratti di carne – 5g;
- Estratto di lievito – 1g;
- Cloruro di Litio – 9g;
- Xilosio – 10g;
- Rosso fenolo – 0.12g;
- Attivatori di crescita – 2g;
- Soluzione cromogena – 1ml;
- Soluzione selettiva – 20ml;
- Agar B -13g;
- Acqua distillata – qsp 1.000 ml.
pH finale a 25°C = 7,2 ± 0,2
Alla base di questa lista, bisogna considerare che ciascuno di questi ingredienti che coinvolgono il terreno di coltura batterico, sia in forma disidratata che in flacone, comporranno le piastre che rileveranno la presenza di L.monocytogenes.
Preparazione del terreno
Di seguito, si descrivono i passaggi necessari per la preparazione del terreno di coltura batterico RAPID’L.mono Agar e la rilevazione di L.monocytogenes e le altre specie. Pertanto, ogni fase deve essere seguita per garantire l’affidabilità e l’accuratezza dei risultati, assicurandosi di lavorare in condizioni asettiche.
Preparazione del terreno di coltura
- Per prima cosa dissolvere 68,1 g di polvere in 950 ml di acqua distillata, per poi mescolare ed ottenere una sospensione omogenea.
- Riscaldare la sospensione per un massimo di 2 minuti per poi lasciarla raffreddare a 45-50°C.
- Una volta raffreddata, omogeneizzare il contenuto aggiungendo due fiale di supplemento, ciascuna ricostituita con 14 ml di acqua sterile.
- Dopodiché, versare la sospensione su piastre di Petri e lasciarle solidificare su una superficie piana e fredda, senza impilarle.
- A questo punto passare al flacone contenente il RAPID’L mono Agar da raffreddare a bagnomaria bollente.
- Una volta tolto dalla condizione a bagnomaria, per la purificazione del campione, agitare manualmente il flacone per riossigenare il deposito. Di nuovo, portare il flacone a bagnomaria a raffreddare, fino a farlo arrivare tra i 45-50°C.
- Una volta arrivato a temperatura, aggiungere i supplementi al flacone e mescolare bene.
- Anche qui, bisogna versare il contenuto del flacone nelle piastre di Petri, senza impilarle, e lasciarle a solidificare.
La preparazione del terreno di coltura disidratato (in polvere) porterà alla produzione 7,4L di terreno. mentre la preparazione de flaconi porterà ad una loro riproducibilità per 13 piastre.
Rilevazione di L.monocytogenes e specie di Listeria spp.
Dopo aver preparato la base del terreno di coltura, passiamo a questo momento di produzione della piastra, che rileverà la presenza batterica delle colonie delle specie Listeria:
- Innanzitutto, diluire una quantità di campione (estratto lievito o carne) nel terreno di arricchimento (Brodo Fraser).
- Omogeneizzare con un agitatore per poi incubare il brodo a 30°C per 24h.
- Conservare il brodo tra 2-8°C, per un massimo di 72 ore, che servirà alle colonie delle specie per assorbire il nutriente (xilosio), e consentire così la loro identificazione.
- A questo punto prelevare 0,1 ml di campione con una pipetta sterile e depositare le gocce sul bordo esterno di metà della superficie di agar.
- Si procede così a distribuire il campione con le specie agitandolo avanti e indietro su metà della superficie agar, usando una pipetta di Pasteur sterile o un’ansa per inoculazione.
- Ripetere alla stessa maniera il processo per l’altra metà della superficie, isolando in questo modo le colonie delle specie Listeria.
- Conservare alla fine le piastre incubate tra i 2-8° per 72h.
Conta finale di L.monocytogenes
Abbiamo le nostre piastre ben conservate, con le specie identificate dal loro colore, da cui dobbiamo estrarre il numero degli individui. prima di contare direttamente, bisogna diluire il campione delle piastre in una soluzione chiamata BPW (Buffered Peptone Water), poiché necessaria alla sopravvivenza dei batteri (componente del terreno di coltura). Su base arbitraria, si decide di effettuare ulteriori diluizioni; nel caso si riscontri un’alta o una bassa densità batterica. Dopodiché si distribuiscono su più piastre per garantire un’accuratezza maggiore e si conta direttamente.
Risultati della crescita del terreno di coltura
dal risultato finale del terreno di coltura in polvere e in flacone, ovvero le piastre, le colonie di Listeria appariranno sferiche e lisce. Le colonie di L.monocytogenes saranno contraddistinte dal loro tipico colore blu chiaro, grigio blu o blu scuro, senza alone giallo. L’intensità del blu indica la quantità di xilosio (nutriente del terreno di coltura che incrementa la proliferazione) assimilato dalla specie. Le colonie di Listeria spp. appariranno bianche o giallo chiaro, poiché inabilitate ad assimilarlo. Se il gene Listeria (escluso da L.monocytogenes) risulta “non rilevato” sono necessarie ulteriori 48h di incubazione.
Limitazioni del terreno di coltura batterico
I limiti del terreno RAPID’L.mono Agar includono la difficoltà nella differenziazione di specie, dovuta allenta assimilazione dello xilosio che può portare a confondere ceppi di L.monocytogenes con altri. Sebbene selettivo, il terreno di coltura RAPID’L.mono Agar, rischia la contaminazione da parte dei microrganismi quali batteri gram positivi, gram negativi, lieviti e muffe.
Conclusioni
Sostanzialmente, possiamo concludere che i vantaggi di questa tecnica di preparazione del terreno di coltura, superano senza dubbio gli svantaggi, poiché rispetto ai metodi tradizionali che richiedono tra le 72-96h per l’identificazione, qui otteniamo degli ottimi risultati in 24 ore. Oltretutto, L’efficienza dei risultati è maggiore grazie alla soluzione cromogena, poiché sappiamo già se il campione da testare sarà invaso da L.monocytogenes, senza avere necessità di conferma. Infine, si riducono i costi dei materiali e i passaggi, che coinvolgono soltanto una piastra ed un brodo di arricchimento.
Fonti
- Wendy F. Lauer, Jean-Pierre Facon e Asmita Patel. 2005. “Evaluation of a Chromogenic Medium for Identification and Differentiation of Listeria monocytogenes in Selected Foods”. Journal of AOAC International, vol. 88, no.2.
- Bio-Rad Laboratories. “RAPID’L.mono Medium”. Bio-Rad, January 2024 – RAPID’L.mono Medium | Bio-Rad
- Bio-Rad Laboratories. “iQ-Check Listeria spp. Kit User Guide”. Bio-Rad, January 2024 – https://www.bio-rad.com/sites/default/files/2024-01/10000167777.pdf
- Bio-Rad Laboratories. “iQ-Check Listeria monocytogenes II Kit User Guide”. Bio-Rad, January 2024, https://www.bio-rad.com/sites/default/files/2024-01/10000167776.pdf
- Bio-Rad Laboratories. “RAPID’L.mono Agar User Guide”. Bio-Rad, “s.d”, https://www.bio-rad.com/sites/default/files/webroot/web/pdf/fsd/literature/10000127436.pdf
Crediti immagini
- Immagine in evidenza: https://en.wikivet.net/File:Listeria_3.jpg#filehistory
