Clostridium difficile

Caratteristiche

Clostridium difficile è un batterio anaerobio, Gram-positivo, normalmente presente nella flora batterica vaginale e intestinale (60% bambini e 3% adulti).

Fu scoperto da Hall e O’Toole (1935) nelle feci di neonato: Bacillus difficilis, chiamato così per la difficoltà incontrata nell’isolamento e per l’estrema lentezza di crescita dello stesso sul terreno colturale. Nel 1970 fu rinominato come Clostridium difficile.

Le vie di infezione per questo batterio è tramite le feci, in cui è possibile infettarsi tramite:

  • Le mani
  • La bocca
  • Altre mucose (naso e occhi)

Questo bacillo è stato spesso sottovalutato da un punto di vista clinico, finché non si scoprì che produce diverse tossine, le quali causano malattie del tratto grastrointestinale.

Tali malattie vanno da forme benigne di diarrea fino a coliti pseudomembranose, con conseguenze anche gravi.

Filogenesi

DominioProkaryota
RegnoBacteria
PhylumFirmicutes
ClasseClostridia
OrdineClostridiales
FamigliaClostridiaceae
GenereClostridioides
SpecieC. difficile

Morfologia delle colonie

C. difficile viene coltivato nel terreno di coltura “5 BD Clostridium Difficile Agar with 7% Sheep Blood” in cui vengono utilizzati elementi di nutrimento come:

  • Peptone e fruttosio che forniscono l’azoto e il carbonio necessari, i fosfati mantengono il pH;
  • Cicloserina e cefoxitin sono agenti selettivi che sopprimono i batteri associati;
  • Il sangue di montone fornisce sostanze nutritive e consente una buona sporulazione e la rilevazione di una fluorescenza verdastra visibile con luce UV.

Dopo 48 – 72 h di incubazione, Clostridium difficile appare sotto forma di colonie bianco-grigie simili a vetro smerigliato con bordo lievemente filamentoso ma senza segni di beta-emolisi. Le colture ben sviluppate hanno un odore caratteristico simile a quello di una scuderia, causato dall’accumulo di p-cresolo.

C. difficile cresce anche su Agar sangue (Figura 1), dove presenta un diametro di 2 mm o più dopo 24 ore di incubazione, fluorescenza giallo-verde (Figura 2).

Di seguito una tabella con tutti i mezzi di coltivazione consigliati:

Per la coltura:Agar sangue anaerobico o Brucella con H&K.
Per isolamento selettivo:PEA anaerobico, agar fruttosio-cicloserina-cefoxitina (CCFA; per Clostridium difficile ).
Per l’identificazione:Agar tuorlo d’uovo.
Per il mantenimento:Terreni di carne cotta o tioglicollato con integratori.

Patogenesi

Quando viene a contatto con l’uomo, mediante il contatto con oggetti e superfici contaminate in cui riesce a sopravvivere per lunghi periodi, produce nell’intestino una tossina necrotizzante causando:

  • Febbre
  • Nausea
  • Dolori addominali
  • Colite
  • Diarrea

Le persone più a rischio di contrarre questa infezione sono quelle che sono sottoposte a un lungo periodo di antibiotici.

Gli antibiotici distruggono la flora intestinale (per rimuovere le infezioni presenti), ma il C.difficile essendo abbastanza resistente continua ad accrescersi producendo 2 tipi di tossine:

  1. Tossina A (enterotossina= attacca le mucose dell’intestino)
  2. Tossina B (citotossina= ha un effetto tossico sulle cellule)

Entrambe le tossine contribuiscono alla malattia, la produzione di una sola tossina o di entrambe non è sufficiente tuttavia a provocare la malattia. Infatti sono di estrema importanza anche:

  • Le proteine degli strati della superficie batterica (SLPs), importanti per il legame di C. difficile all’epitelio intestinale, seguita da una produzione localizzata di tossine e da danno tissutale;
  • Le ialuronidasi con attività idrolitica.

Queste due tossine danneggiano la parete del canale digerente (colon, intestino) causando una grave infiammazione del colon, provocando la morte dei tessuti che lo compongono e insieme a fibrina e i leucociti formano una parete (di colore biancastro) al di sopra della parete infiammata dell’intestino (pseudomembrana) determinando una patologia nota chiamata colite pseudomembranosa.

Una conseguenza più grave causata dal C. difficile è il megacolon tossico (Figura 3) cioè una dilatazione dell’intestino che si crea come conseguenza dei danni causati dal processo infiammatorio ai plessi nervosi responsabili della motilità del colon. Una complicanza molto pericolosa è la perforazione dell’intestino da cui può conseguirne una sepsi ed infine la morte.

megacolon tossico

Figura 3 – Istologia di un megacolon tossico

Biofilm e spore

Durante lo sviluppo del biofilm, C. difficile forma due tipi diversi di spore, le quali possiedono uno strato di esosporio spesso o sottile. Queste osservazioni sono fortemente supportate da microfotografie elettroniche di trasmissione di colture sporulanti (Figura 4 ).

Presenza di due morfotipi distintivi dello strato di esosporio in colture sporulanti di spore di C. difficile

Figura 4 – Presenza di due morfotipi distintivi dello strato di esosporio in colture sporulanti di spore di C. difficile. (A) Microfotografia elettronica rappresentativa di colture sporulanti che dimostra la presenza di spore con uno spesso strato di esosporio (frecce nere) e spore con uno strato sottile di esosporio (frecce bianche). (Da B a E) Micrografie elettroniche a trasmissione ingrandite di spore con uno strato di esosporio spesso (B e C) o sottile (D ed E). 

Indipendentemente dalle condizioni in cui si formano le spore (Figura 5), il C. difficile produce spore con due diversi morfotipi dello strato di esosporio. Ciò dovrebbe essere preso in considerazione nello sviluppo di strategie di rimozione delle spore basate sulle proteine ​​dell’esosporio per garantire uno sviluppo efficiente di nuove strategie per combattere le infezioni da C. difficile .

Microfotografia elettronica a trasmissione di C. difficile che forma un'endospora

Figura 5 – Microfotografia elettronica a trasmissione di C. difficile che forma un’endospora (in alto a sinistra). 

Metodi di identificazione

La diagnosi di diarrea indotta da Clostridium difficile deve essere sospettata in ogni paziente che sviluppa diarrea entro 2 mesi dall’uso di antibiotici o 72 h dal ricovero ospedaliero, successivamente si effettuano 2 procedimenti:

  • Dosaggio di feci per il riscontro del glutammato deidrogenasi prodotto dalla tossina del C. difficile e PCR (reazione a catena della polimerasi) per il gene della tossina.
  • Sigmoidoscopia che può confermare la presenza di pseudomembrane, se i pazienti hanno ileo o se i saggi tossinici non sono diagnostici.

L’enterotossina e la citotossina sono rilevabili attraverso diversi saggi
immunoenzimatici
. La citotossina può anche essere rilevata con un saggio di tossicità in vivo, attraverso le colture di cellule e specifici anticorpi neutralizzanti la tossina.

Al microscopio i Clostridi presentano tutta una serie di caratteristiche, che riassumiamo nella tabella qui di seguito:

Colorazione di Gram:Di solito Gram-positivi.
Morfologia:Le cellule della maggior parte dei ceppi si presentano con forma bastoncellare diritte o leggermente curve.
Dimensione:0,3-2,0 micrometri da 1,5-20,0 micrometri di lunghezza.
Motilità:La motilità si verifica attraverso un flagello peritrico.
Capsule:Nessuna.
Spore:Clostridium spp. forma endospore ovali o sferiche che solitamente distendono la cellula.
Altro:La maggior parte ha estremità rotonde e affusolate; filamenti lunghi sono presenti in alcune specie.

Proprietà metaboliche

Anaerobico obbligati, sebbene alcuni ceppi (ad es. Clostridium perfringens ) possano effettuare la respirazione dei nitrati.

Reazioni biochimiche chiave

Di solito catalasi negativo.

Terapia

Il trattamento prevede l’interruzione dell’assunzione dell’antibiotico che si era dato in precedenza e si procede con la somministrazione di una specifica terapia antibiotica orale con antibiotici specifici in cui il batterio e particolarmente sensibile (Vancomicina orale o fidaxomicina orale).

Nella maggior parte dei casi, i soggetti riescono a migliorare il tratto gastrointestinale in cui permette la ripopolazione della flora batterica intestinale, però circa il 12-24% dei pazienti può ripresentare i sintomi dell’infezione.

Tuttavia la terapia è varia, a seconda delle differenti forme di malattia:

  • Forma lieve: è sufficiente la sospensione della somministrazione degli
    antibiotici responsabili dell’insorgenza della malattia.
  • Forma grave: è necessaria una terapia con metronidazolo o vancomicina.

Si possono verificare ricadute nel 20-30% delle volte dopo il completamento della terapia, la causa è da ricercare nel fatto che restano uccise solo le forme vegetative, ma non le spore.

Un secondo ciclo di trattamenti con il medesimo antibiotico, normalmente è
risolutivo.

Prevenire la malattia da C. difficile è complicato. Il microrganismo esiste normalmente negli ospedali e le spore sono difficili da eliminare, a meno dell’utilizzo di pratiche igieniche continue.

Autore: Giuseppe Miccione e Luigi Copia, Revisionato da Salvatore Gemmellaro

Fonti:

Informazioni su Salvatore Gemmellaro 100 Articoli
Non ho mai fatto della Scienza solo una materia di studio ed una passione personale, ma l’ho sempre ammirata come un’opera d’arte. Riesco a vederne la bellezza. I miei contemporanei probabilmente vedono solamente basi di Rna, gli enzimi. Io vedo Picasso, le più stupende sculture della biologia, vedo i Virus. Sono laureato in Scienze Biologiche, ed intendo dar del mio, in futuro, nel mondo della ricerca scientifica.

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