Il nuovo e importante capitolo EP 2.6.32: una scatola vuota?

Un nuovo capitolo di Farmacopea Europea per il rilevamento delle endotossine

Pubblicato già nel giugno 2019, il 1° gennaio 2021 è entrato in vigore un importantissimo capitolo di Farmacopea Europea, il cui scopo è quello di definire l’utilizzo del reagente ricombinante per il rilevamento delle endotossine.

Che cosa sono le endotossine e perché è così importante identificarne la presenza?

Le endotossine sono lipopolisaccaridi, componenti di parete dei gram-negativi, strutturati in quattro porzioni: la catena O-specifica, due regioni (una interna ed una esterna) oligosaccaridiche ed il lipide-A (Fig. 1). Questo lipide-A è in grado da solo di provocare tutti gli effetti biologici tipici delle endotossine attivando il complemento, legandosi alle lipoproteine del siero ed interagendo con i recettori di membrana di monociti, macrofagi e altri tipi di cellule.

Schema endotossine e parete batterica  (LAL aspetti teorici e problemi pratici – Buone pratiche di Fabbricazione Linee guida AFI vol VII)
Figura 1: Schema endotossine e parete batterica (LAL aspetti teorici e problemi pratici – Buone pratiche di Fabbricazione Linee guida AFI vol VII)

Gli effetti fisiologici delle endotossine

Gli effetti fisiologici delle endotossine sono chiaramente dose-dipendenti. Dosaggi fino a 5 picogrammi non sembrano indurre effetti fisiologici. Un dosaggio di 1 ng/kg può dar luogo a febbre (anche se questo valore può variare di molto in funzione della specie di batterio gram-negativo considerato). La febbre è indotta da un’iniziale attivazione del sistema immunitario ad opera dei recettori TCR4-specific per le endotossine presenti su monociti e macrofagi. Sempre a questi dosaggi si può avere una blanda ipotensione.

A dosi dell’ordine di μg, gli effetti sono molto più rilevanti: si può avere ipotensione, coagulazione intravascolare diffusa, edema polmonare fino ad arrivare alla morte. La dose letale è calcolata attorno agli 1-2 microgrammi/kg.

Le endotossine e le produzioni farmaceutiche

Le endotossine sono molecole termostabili e difficilmente removibili con i normali cicli di sterilizzazione. Costituiscono un serio problema per le produzioni farmaceutiche parenterali in quanto si possono ritrovare in farmaci che sono sì sterili (in quanto privi di batteri o funghi), ma non apirogeni, cioè privi di elementi in grado di dar luogo alla febbre oltre a tutti gli effetti sopracitati. È quindi assolutamente necessario l’utilizzo di sistemi di rilevamento delle endotossine sufficientemente sensibili ed accurati.

Come vengono rilevate le endotossine?

Ad oggi il gold standard, nonché il metodo assolutamente più utilizzato per il rilevamento delle endotossine batteriche è il LAL test. Il reagente LAL si estrare dal sangue del Limulus Polyphemus, un artropode marino che abita le coste atlantiche degli Stati Uniti (da non confondersi con il TAL, analogo reagente ma estratto dal Tachipleus tidentatus, che invece colonizza le coste asiatiche). Il LAL è il reagente utilizzato in Occidente mentre il TAL è essenzialmente utilizzato in Cina in quanto non riconosciuto in Europa e negli USA. Questo reagente è un qualcosa di più di una semplice proteina: è un mix di proteine e cofattori che dà origine alla cascata enzimatica riportata nello schema semplificato in Fig.2.

Cascata enzimatica del lisato di Limulo endotossine

Figura 2: Cascata enzimatica del lisato di Limulo

La sensibilità che questo metodo può raggiungere è dell’ordine dei picogrammi, pari a circa due sole molecole disciolte in 1 ml di acqua. Per far capire meglio questa sensibilità possiamo utilizzare l’esempio della piscina olimpica. Il LAL test sarebbe in grado di verificare la presenza di un granello di sabbia in un contenitore grande quanto una piscina olimpionica.

La storia del LAL test

In passato il LAL test ha sostituito il metodo dei pirogeni in vivo, utilizzato per decenni, in quanto più sensibile, più rapido e assolutamente più efficace. Negli anni ‘70 fu pubblicato il più importante studio comparativo tra il LAL test ed il test in vivo sul coniglio, condotto su decine di migliaia di test. In nessun caso si era ottenuto un falso negativo nel caso del LAL test, al contrario di quanto succedeva per il test sul coniglio. Probabilmente questo fu uno degli studi più importanti che portò alla definitiva sostituzione del test dei pirogeni sul coniglio per la ricerca delle endotossine batteriche.

Il LAL test ha quindi finora rappresentato il metodo di elezione nella ricerca delle endotossine batteriche.

Il LAL test oggi

Recentemente sono stati sviluppati dei reagenti di origine sintetica comunemente chiamati rFc (recombinant Factor C). Sono reagenti sviluppati per mimare quanto accade nel LAL test. Il reagente rFc ricombinante non esprime tutta la cascata enzimatica, ma il solo Fattore C, ritenuto essere l’unico elemento responsabile del riconoscimento delle endotossine. (Fig. 3)

Cascata enzimatica dei reagenti ricombinanti basati sul Fattore C (rFc) endotossine

Figura 3: Cascata enzimatica dei reagenti ricombinanti basati sul Fattore C (rFc)

Esistono poi altri reagenti ricombinanti in cui sono stati inseriti ulteriori elementi della cascata enzimatica, oltre al solo fattore C. Questi reagenti, secondo quanto indicato nel capitolo USP 1085.1 (draft) sono definiti recombinant cascade reagent o rCR in quanto contengono anche il fattore B, il pro-clotting enzyme e il substrato cromogeno come mostrato in Figura 4 (5).

Cascata enzimatica dei reagenti ricombinanti basati sul recombinant Cascade Reagent (rCR) endotossine

Figure 4: Cascata enzimatica dei reagenti ricombinanti basati sul recombinant Cascade Reagent (rCR)

Reagenti tradizionali e ricombinanti

Cosa comporta la semplificazione in termini di elementi di reazione che si ha nel passaggio da un reagente tradizionale ed un reagente ricombinante (rFc o rCR)? L’assenza di una cascata enzimatica completa, come nel caso del rFc, comporta innanzitutto la necessità di utilizzare della strumentazione più sensibile, ad esempio di un lettore di fluorescenza. Nel caso del rCR, invece, l’amplificazione del segnale, possibile grazie alla presenza di una cascata enzimatica completa, permette la lettura con un classico spettrofotometro con incubazione e lunghezza d’onda a 405nm, lo stesso che si utilizza per un LAL cinetico tradizionale.

Un secondo aspetto da considerare è la complessità del meccanismo che porta all’attivazione del fattore C. Secondo recenti studi sembra sia necessaria la formazione di aggregati di Fattore C e la contemporanea presenza anche del fattore B affinché si abbia un efficace riconoscimento delle endotossine da parte del reagente LAL. Questi studi sollevano quindi il dubbio che tutto possa essere semplificato in LPS + rFc = reazione.

Il capitolo EP 2.6.32

Ma torniamo alle normative: come detto, è recentemente entrato in vigore un nuovo capito nella Farmacopea Europea (EP) relativo a questi reagenti ricombinanti, il capitolo EP 2.6.32. Unitamente alla pubblicazione di questo capitolo, è stato modificato anche il capitolo EP 5.1.10, cioè le linee guida riferite al LAL test. La principale modifica operata sul capitolo EP 5.1.10 (anch’esso effettivo dal 1 gennaio 2021) si trova nei punti 12 e 13.

In particolare, al punto 12 si cita:

“The method described in general chapters 2.6.14, 2.6.30 and 2.6.32 therefore don’t have to be revalidated per se, other than in consideration of their use for a specific substance or product in a specific analytical environment”

mentre al punto 13:

“Replacement of a method prescribed in a monograph by another method described in Ph. Eur. is to be regarded as the use of an alternative method in the replacement of a pharmacopoeial test as described in the General Notice”

The Alternative method doesn’t have to be revalidated per se other than in consideration of its use for a specific substance or product in a specific analytical environment and its equivalence to the prescribed method.

Discussione

Sulla base di questi due punti, così come alla luce dello specifico capitolo 2.6.32, risulta evidente che siamo di fronte ad un nuovo metodo compendiale che non richiede più, come altri metodi alternativi, una validazione del metodo di per sé prima di andare ad implementarlo nei laboratori farmaceutici. Quanto in EP conferma che il metodo rFc è da considerarsi in Europa un metodo ufficiale. Tuttavia, nell’ultima frase del paragrafo 13 si utilizza il concetto di equivalenza rispetto ai metodi descritti, specificatamente per il prodotto in esame. Questo è esattamente quanto è stato ribadito, durante il recente Pharmalab 2020 tenutosi in Germania da parte di Dr. Emmanuelle Charton (Head of Division B European Pharmacopoeia Department EDQM) nel suo intervento chiamato “Validation of alternative methods: the perspective from the European Pharmacopoeia”, chiarendo qualcosa in merito all’implementazione del metodo ricombinante.

Ha sì confermato che il metodo ricombinante è diventato compendiale, ma ha parimenti fatto notare che, qualora si intenda utilizzarlo per prodotti farmaceutici, occorre andare a considerare le monografie di prodotto oppure quelle generiche.

Insulina e Water for Injection

Citiamo ad esempio l’insulina oppure la Water for Injection: questi prodotti hanno una specifica monografia, rispettivamente la 08389 e la 0169. In entrambi i casi (ma la cosa è vera per tutti i prodotti per cui è richiesta la determinazione delle endotossine), si cita unicamente il metodo EP 2.6.14. Questo è vero anche nelle monografie generali come la 2034 (Substance for Pharmaceutical use) oppure la 0520 (Parenteral preparation), importantissime monografie generiche per le materie prime e per le preparazioni parenterali.

L’utilizzo di un metodo ricombinante per i prodotti che rientrano in queste categorie sarebbe a tutti gli effetti equivalente all’utilizzo un metodo alternativo, così come citato in EP 5.1.10. Questo perché in questi capitoli è espressamente richiesta la EP 2.6.14

Sulla base di quanto citato in EP 5.1.10 punto 13,

 “…and its equivalence to the prescribed method…”

sembrerebbe necessario valutare l’equivalenza tra i due metodi in comparazione, così come indicato in EP 5.1.6 Alternative methods for control of microbiological quality.

Questo non significa che debbano essere valutati per intero tutti i parametri citati in quel capitolo, tuttavia non basterebbe la semplice validazione di prodotto (suitability) per dimostrarne l’equivalenza.

Conclusioni

Questo ci riporta al titolo dell’articolo: siamo potenzialmente di fronte ad una scatola vuota. L’attuale quadro regolatorio ha dato una notevole spinta verso l’implementazione dei metodi ricombinanti senza però dare gli effettivi mezzi per un suo rapido utilizzo. È una situazione simile a quella di leggi approvate ma non affiancate dai decreti attuativi necessari per rendere le norme efficaci.

Il metodo è riconosciuto ma non interamente accettato dal quadro normativo attuale. Saranno necessari ulteriori step regolatori affinché vengano eliminati gli ultimi paletti per un suo utilizzo sostitutivo di (o in affiancamento a) i reagenti LAL convenzionali cui si riferisce la 2.6.14, o quantomeno sarà necessario che questi aspetti regolatori vengano meglio specificati.

Possiamo dire che la direzione verso cui muoversi è chiara, ma che c’è ancora un po’ di strada da fare affinché i metodi ricombinanti possano sostituire il LAL test. Nei prossimi anni probabilmente vedremo un affiancamento tra le due tecnologie ciascuna delle quali è dotata di vantaggi e svantaggi, ma ad ora è difficile immaginare in tempi rapidi una sostituzione completa del LAL test da parte del rFc o di un rCR.

Si ringrazia il dott. Alessandro Pauletto per l’articolo “Il nuovo e importante capitolo EP 2.6.32: una scatola vuota?”

Bibliografia

  1. LAL aspetti teorici e problemi pratici – Buone pratiche di Fabbricazione Linee guida AFI vol VII
  2. LAL aspetti teorici e problemi pratici – Buone pratiche di Fabbricazione Linee guida AFI vol VII
  3. Trudy M. Wassenaar1 and Kurt Zimmermann – Lipopolysaccharides in Food, Food Supplements, and Probiotics: Should We be Worried? Eur J Microbiol Immunol (Bp). (2018) Sep 28; 8(3): 63–69.
  4. Mascoli, C. C., and Weary, M. E. “Applications and Advantages of the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Pyrogen Test for Parenteral Injectable Products.” Biomedical Applications of the Horseshoe Crab (Limulidae). (1979) Alan Liss, 150 Fifth Avenue, New York, NY 10011, 387–402.
  5. rFC–from Genetic Engineering to Endotoxin Detection –  Jeak Ling DING (Lynne) – 2018 PDA Endotoxins Workshop October 17-18 2018
  6. USP Draft 〈1085.1〉 Use Of Recombinant Reagents In The Bacterial Endotoxins Test—Photometric And Fluorometric Methods Using Recombinantly Derived Reagents
  7. Toshio Shibata  et al, Intermolecular autocatalytic activation of serine protease zymogen factor C through an active transition state responding to lipopolysaccharide – J Biol Chem (2018) Jul 20; 293(29):11589-11599.
  8. Masakazu Tsuchiya – Innovative mechanism of limulus amebocyte lysate activation to achieve specificity and sensitivity to endotoxin; comparison with recombinant factor c reagents – Int J Dev Res (2020), June, Vol. 10, Issue, 06, pp. 36751-36756.
  9. European Pharmacopeia 2.6.32 Ed 10.3
  10. European Pharmacopeia 5.1.10 Ed 10.3
  11. European Pharmacopeia 2.6.32 Ed 10.3

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