Turtle ants: volatrici in cuticola, per i batteri addominali

Checchè se ne dica, in natura, l’abito fa il ruolo e, di certo, il nome. Le più antiche classificazioni sistematiche, infatti, non hanno mai trovato di meglio che rivolgere i propri cenni connotativi alla contingente gamma zoomorfa, sconfinando lietamente in altri phyla. Così, appaiono le turtle ants (Figura 1), “formiche tartaruga”, dalla spessa cuticola, quasi carapace tripartito, con in serbo bizzarrìe etologiche.

Quel che guida, però, l’odierna ricerca sul curioso insetto è il merito batterico della sua scocca cuticolare. Dono dei batteri addominali, nello specifico.

Turtle ant, formica tartaruga, dalle abitudini erbivore, che plana dall'alto dei suoi nidi arborei, grazie a specilizzazioni della propria cuticola. — *Figura 1 – Variante di turtle ant, del genere* Cephalotes, in cui si spiega il connotativo zoologico.
Fonte: https://www.alexanderwild.com/Ants/Taxonomic-List-of-Ant-Genera/Cephalotes/i-Nzcvc9x/A

Da Myrmicinae, genere Cephalotes, a «turtle ants»

E pervenuti
de' Mirmidoni alla campal marina
trovâr l'eroe seduto appo le navi
davanti al padiglion: né del vederli
certo Achille fu lieto.

La sottofamiglia Myrmicinae, vanta, oltre al prestito di prefisso per illustri etimi epici, la discendenza d’ordine dei Cephalotes, formiche dotate di rigonfiamento terminale, per questo, quindi, κεφαλοδες «capitate». Oggi, denominate per connotazione più “superficiale”. Diffuse nelle regioni tropicali dell’Argentina ed a Panama, le turtle ants abitano con successo gli altissimi rami d’albero, correndo avanti e ‘ndre, alla ricerca di cibo. Le fatali cadute sono, dunque, all’ordine dell’istante. Per questo, una fantasiosa specializzazione del tessuto di rivestimento ha fatto, per loro, di necessità virtù. Il volo planato. Ebbene sì. Esse hanno, all’uopo, una testa appiattita, atta a rallentarne la caduta, e zampe posteriori ed addome allenati al controllo della posizione del corpo in aria. Un affascinante paracadute, non c’è che dire.

L’evoluzione è figlia dell’adattamento

La grande e vincente evoluzione delle formiche è solo parzialmente correlata alla specializzazione della cuticola, esoscheletro e corazza accessoriata, ma il resto è l’esito di un opportuno cambio di dieta. Durante la loro silenziosa resistenza, infatti, le turtle ants hanno sostituito le abitudini onnivoro-carnivore con quelle erbivore. Destinandosi a rinunciare ad un cospicuo introito di azoto per uno meno che irrisorio. Ma, come per le migliorìe metabolico-nutrizionali nell’uomo, anche nel mondo imenottero i nutrienti disponibili modulano la composizione microbica dell’ospite. L’offerta fa il richiedente. E, a ben vedere, i pervenuti microbici sono in grado di sostenere, con prodotti di sintesi naturali emergenti dai loro stessi cicli biochimici, le necessità organiche dell’individuo-habitat. Nelle formiche del genere Camponotus, ad esempio, simbionti intracellulari Blochmannia hanno provveduto alla sintesi supplementare di numerosi aminoacidi, per incrementare l’apporto e l’assimilazione dell’azoto, negli ospiti. A vantaggio, poi, sia dello sviluppo larvale sia del futuro esito riproduttivo.

I simbionti di Cephalotes

E così, anche il genere Cephalotes (Figura 2) di formiche tartaruga, erbivore, può far fronte alle ridotte concentrazioni di azoto fornite dai loro pasti vegan grazie a proficue relazioni batteriche, nel loro stesso addome. Jacob A. Russel e colleghi, infatti, ebbero, in passato, modo di rilevare l’appartenenza dei simbionti in questione al gruppo dei riciclatori di azoto. Simbionti addominali, quindi, filogeneticamente distanti e generazionalmente conservati, che favorivano l’assimilazione dell’azoto proveniente da aminoacidi giustappunto neosintetizzati, essenziali e non essenziali. Sono Burkholderiales, Pseudomonadales, Rhizobiales, Verrucomicrobiales e Xanthomonadales. Essi possiedono geni biosintetici complementari e simili, in grado di riciclare l’urea e produrre aminoacidi multipli. Il che svela anche il notevole bisogno aminoacidico dell’ospite.

Le turtle ants, formiche tartaruga sono dotate di mandibole robuste e di un capo appiattito e voluminoso. — Figura 2 – Cephalotes, la cui classe di operaie è caratterizzata da un capo voluminoso e robusto e mandibole forti, pur meno sviluppate di quelle dei soldati. Fonte: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cephalotes_atratus_casent0010676_head_1.jpg

Hisashi Anbutsu e colleghi, inoltre, hanno appurato che tra gli aminoacidi batterici neosintetizzati, la tirosina, nello specifico, sia coinvolta proprio nella formazione della cuticola. E in effetti più di un gruppo di ricerca ha confermato la trasmissione verticale degli endosimbionti produttori di tirosina. Senza i quali, quindi, gli esiti cuticolari sarebbero poco meno che fallimentari. Una cuticola sottile, morbida e rossastra, invece che scura e rigida.

Tracce isotopiche nelle turtle ants: la simbiosi si fa cuticola

Tutto si può dire, eccetto che la cuticola degli insetti sia un solo residuato, inerte, primitivo, un accessorio fenotipico; visto che è nell’efficacia di quest’organo che risiede la facoltà di adattamento di base degli artropodi tutti alle innumerevoli nicchie ecologiche nello sconfinato, minuto, mondo naturale.

Studi precedenti sul tema hanno rilevato, però, solo variazioni e cambiamenti fisici della cuticola, in assenza di simbionti, senza neppure indicare i componenti molecolari specifici, colpiti dal vuoto microbico.

Per centrare subito l’indagine sulla composizione cuticolare delle turtle ants, i ricercatori, guidati da Christophe Duplais, hanno predisposto un’analisi di tipo isotopico. Essi hanno infatti nutrito le formiche con urea marcata dall’isotopo ¹⁵N, in presenza ed assenza di antibiotici. Così, hanno potuto rilevare l’effettivo contributo dei batteri alla formazione della sacra cuticola, già in fase di sviluppo dei Cephalotes.

Con impiego, poi, di NMR, gli operatori hanno documentato e caratterizzato i cambiamenti nell’asse addome-cuticola. In attesa, comprensibilmente, di veder balzare all’occhio prodotti arricchiti in ¹⁵N: matrici proteiche, di chitina e catecolamine. La N-Beta-Alanildopamina (NBAD), per esempio, è il principale agente catecolico colorante, precursore tipico, nella cuticola degli insetti gialli e bruni.

Una cuticola di lusso

Possedere una buona cuticola, per le turtle ants, non è roba da poco. Costa azoto, che spesso non si possiede, per via, come detto, della nuova dieta. Diventa uno status symbol, che le operaie, in braghe di tela, non possono permettersi. Affiora dall’epidermide che la secerne, se il privilegiato dispone di simbiosi addominali idonee, di aderenze microbiche. E’ composta da 4 strati:

cemento, l’ultimo strato lipo-proteico;
cere, lo strato di lipidi ed idrocarburi, prodotto dopo la muta;
due epicuticole, l’esterna, di proteine, lipidi e simil-paraffine, l’interna, di proteine, lipidi e composti aromatici; entrambe già prodotte durante la muta;
procuticola, che contiene chitina, con la sua misteriosa rigida elasticità, per nulla ostile al volo.

Cronache di laboratorio

Incluse nelle prove sperimentali sono 6 colonie di C. varians, provenienti dal Florida Keys, USA. Divise in due gruppi sperimentali, le colonie hanno composto rispettivamente un gruppo di individui trattati con antibiotici, ed un altro di non trattati.

Il gruppo degli esemplari trattati con antibiotici, è, così, cresciuto con soluzione acquosa di saccarosio al 30% (w/v), contenente anche 0.01% (w/v) di tetraciclina, rifampicina, kanamicina. Il gruppo degli esemplari non trattati, invece, si è giovato solo della soluzione acquosa di saccarosio al 30% (w/v).

Dopo tre settimane di crescita, nelle suddette condizioni sperimentali differenziali, entrambi i gruppi si sono sviluppati assumendo anche 1% (w/v) di urea marcata con isotopo ¹⁵N.

Indagini genetiche

Per le analisi biomolecolari e genetiche, ogni gruppo ha fornito, suo malgrado, il contenuto addominale, sottoposto poi ad opportuna estrazione genomica, mediante Kit Powersoil Qiagen. L’amplificazione genica, di prassi, ha riguardato la regione 16S dell’rRNA. Ne è subito emerso che il trattamento antibiotico avesse ridotto drasticamente la quantità di batteri nei campioni, da 14’033 a 6’607 16S rRNA in qPCR. Inoltre, l’analisi della diversità nelle comunità batteriche, dei campioni trattati con antibiotici, ha rivelato quasi tutti i contaminanti ambientali transienti, rispetto alle comunità microbiche intatte.

Responsi isotopici

Evidenze quali-quantitative sul contributo fornito dai batteri addominali, delle turtle ants, alla strutturazione della cuticola, i ricercatori le hanno poi raggiunte, impiegando metodi spettroscopici. Lo shift del δ¹⁵N nella cuticola, valutato in spettroscopia di massa, dimostra proprio tale contributo, con un incremento 4 volte superiore nei campioni non trattati, rispetto ai trattati.

La microscopia elettronica a scansione, inoltre, rivela che la cuticola di C. varians non trattato sia 2 volte più spessa rispetto agli esemplari trattati.

NMR per entrare nelle maglie della cuticola

L’approfondimento, per risonanza magnetica nucleare, è iniziato con la registrazione di uno spettro protonico ¹H, al fine di tracciare gli aminoacidi aromatici, noti precursori di melanina e legami crociati chitina-catecolamina, nella cuticola. Risonanze di interesse, appaiono a bassa intensità, nella regione aromatica.

La mappa di correlazione spettroscopica (COSY), poi, 2D ¹H–¹H, ha mostrato numerose correlazioni tra i metaboliti. Specialmente a livello delle aree aromatiche della tirosina e della fenilalanina. La spettroscopia DOSY, invece, ha consentito la quantificazione delle rispettive concentrazioni dei due aminoacidi, in una singola misurazione, di un pool di 5 individui, trattati e non trattati con antibiotici. Per entrambi gli aminoacidi, la concentrazione registrata, in assenza di trattamento, è stata di ~11 μM, il che supera 2 volte quella degli esemplari trattati, pari a ~5 μM.

Quindi, mediante CP-MAS ed NMR, i ricercatori hanno ottenuto risonanza da chitina, proteine e catecolamine, in linea con lo storico J. Schaefer. Le risonanze, inoltre, da ¹⁵N, negli spettri di campioni non trattati, sono parsi qualitativamente (per numero di picchi) e quantitativamente (per intensità dei picchi) inferiori rispetto ai non trattati.

Turtle ants: dai dati ai ragguagli

Originariamente, i ricercatori si aspettavano un arricchimento in ¹⁵N della via di melanizzazione e sclerotizzazione, in forza della scoperta che i batteri addominali incrementassero le concentrazioni di tirosina e fenilalanina disponibili. Sono, questi, i precursori della melanina e della chitina. Ma le ampie risonanze NMR ¹⁵N della melanina, con tutti i suoi picchi multipli, a partire da una miscela complessa di oligomeri (catecolamine, diidrossindolo), non sono poi state osservate nei campioni. Il confronto con spettri standard di melanina è stato impossibile, per l’esigua quantità della sostanza in un campione di 10 mg.

E nonostante la cuticola di C. varians, trattato con antibiotici, sia scura al pari degli esemplari non trattati, non si è potuto appurare il contributo dei batteri alla sintesi di melanina.

I ricercatori di quest’ultimo studio si dichiarano, tuttavia, interessati alla ridondanza funzionale, correlata al flusso di azoto, nei genomi dei simbionti delle formiche tartaruga, alla luce del processo evolutivo ancora in corso. Formulano, pertanto, l’ipotesi che la compresenza di più famiglie batteriche nutrici, a partire da fonti alimentari varie, garantisca, soprattutto, una maggiore costanza nella sintesi di aminoacidi, essenziali per la vita dell’ospite.

Endosimbiosi singole e multiple

Un simile mutualismo multipartito contrasta con l’endosimbiosi a singolo ceppo batterico di Nardonella, presente in molte specie di coleottero, anch’esso implicato nel processo di formazione di una corretta cuticola. Certo, il piccolo genoma di Nardonella presiede solo alla sintesi di tirosina. Ma risultati congeneri si riscontrano anche nel Sitophilus dei cereali, in cui il simbionte Sodalis pierantonius assicura sia tirosina che fenilalanina, durante la metamorfosi di genesi della cuticola.

Nel mutualismo multipartito, però, valutato nelle turtle ants, oltre alla produzione dei due aminoacidi, i batteri addominali assicurano anche la creazione delle maglie di chitina, proteine circolari e catecolamine. Perciò, le strutture macromolecolari, lo spessore, la permeabilità e le proprietà meccaniche della cuticola sono proprio schietta opera batterica.