Rame antimicrobico: le nanoparticelle dal cavolo nero

Nanoparticelle di rame. La loro biosintesi da foglie di cavolo nero. Il mercato richiede sempre nuovi materiali, con proprietà innovative, superiori, rispetto alle classiche matrici plastiche, ceramiche o metalliche. Questo è quanto spinge alla formulazione sperimentale di materiali compositi. Ma la rivoluzione del “nano” è sempre più green.

There’s plenty of room at the bottom!

Richard Feynman, 1959.

La poesia della scienza, che solo le grandi menti sanno porgerci, così semplicemente. Si tratta di Nanoscienza, il cui fascino è legato a doppio filo con la meraviglia. La meraviglia di riscontrare proprietà chimico-fisiche, ottiche ed elettroniche dei materiali, mutate, rispetto alla stessa massa circostante. Persino rispetto alle loro molecole o ai loro atomi isolati. Le Nanoscienze, ormai declinate al plurale dai molteplici ambiti di applicazione, compongono, di fatto, un settore di ricerca relativamente recente. Si occupano di preparazione, manipolazione e studio dei materiali, su scala nanometrica. I nanostrutturati, che ne derivano, presentano una notevole percentuale di atomi di superficie. Questo condiziona, necessariamente, alcune loro proprietà: dopotutto tali atomi saranno l’interfaccia con cui si rapporteranno all’ambiente circostante.

In principio fu il rame

L’antico Egitto, ecco a quando risalgono i primi usi antimicrobici del rame. Uso topico, su lesioni cutanee, infezioni, ustioni. E quando un agente microbicida è tanto affidabile, disponibile ed adoperato, affiora sempre la speranza che esso possa fronteggiare anche patogeni resistenti agli antibiotici. La nostra spada di Damocle. Uno studio recente, condotto da J. Inkinen, pur focalizzandosi sull’efficacia del rame come materiale antibatterico di rivestimento, ha tuttavia rilevato dati sperimentali incoraggianti. Efficace. Efficace, il rame, persino su Staphylococcus aureus meticillina-resistente (MRSA), su isolati clinici di E. coli, Enterococcus spp. vancomicina-resistente (VRE), Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ed Acinetobacter baumannii.

Raffi e colleghi, chiarirono, poi, che, nel campo dei nanomateriali, il rame dovesse la propria competenza antibatterica alla adesione microbica alle nanoparticelle metalliche, grazie all’attrazione tra cariche elettriche opposte. Ciò rivelato, in realtà, da reazioni di riduzione a livello delle pareti cellulari batteriche. M. Raffi sottolineò, inoltre, che quanto più elevato fosse il rapporto superficie/volume delle nanoparticelle attive, tanto più esse sarebbero state efficienti nelle schermaglie microbiche.

Biosintesi green delle nanoparticelle di rame: lo studio

Un nuovissimo lavoro scientifico, condotto da C.S. Sundaram, ha valutato la possibilità di sintesi di nanoparticelle di rame (copper nanoparticles CNP) a partire da estratti vegetali di foglia di cavolo nero, Brassica oleracea var. acephala (Figura 1). Perchè? Le nanoparticelle prodotte da vegetali destano un crescente interesse per il loro profilo eco-friendly e per la loro bassa riduzione d’efficienza in corso d’opera. Inoltre le biosintesi hanno immaginabili pregi in più, rispetto ai metodi di sintesi fisici e chimici convenzionali.

Quella dispensa di fitofarmaci che sono le Brassicaceae

Secondo la American Cancer Society, l’incidenza della degenerazione cellulare, nota con il nome di cancro, si attesta sui 3 milioni, e più, di casi. I risvolti patologici correlati ai trattamenti chemio- e radioterapici sono ancora un doloroso scotto per i pazienti ed uno scoglio insormontabile per la ricerca oncologica. Le prime ipotesi di combinazione terapeutica tra farmaci e fitocomplessi, nel fronteggiare l’iperproliferazione cellurare, emersero già negli anni ’60. Fu allora, infatti, che alcuni gruppi di ricerca isolarono la podofillotossina, la vincristina, la vinblastina, la camptotecina ed il taxolo.

Ad oggi, circa il 65-80% delle popolazioni che abitano paesi in via di sviluppo, impiegano allo scopo ancora erbe medicinali tradizionali. Perchè le credenze popolari sono, di fatto, radicate negli strati più profonti delle culture locali. E’ pur vero che tali piante medicinali tradizionali contrastano realmente alcune alterazioni cellulari oncologiche, grazie a composti chimici naturali altamente antiossidanti. Ed i fitoestratti, fatti oggetto di molteplici studi, su innumerevoli fonti botaniche, dimostrano un contenimento della progressione cancerosa, mediante apoptosi, blocco della disseminazione metastatica e dell’angiogenesi.

Regina delle piante medicinali, la famiglia delle Brassicaceae. Esponente di tutto rispetto, la Brassica oleracea, di origine europea ma ormai ampiamente diffusa in tutto il mondo.

Antiossidanti, antibatteriche ed anticancro

Le Brassicaceae, come broccoli, rape, cavolfiori, cavolo cappuccio, senape e cavolo nero, possiedono strumenti di regolazione del nostro metabolismo, per differenti evenienze e disfunzioni. Sono persino anti-fungine. Senza tralasciare il classico accostamento tra regolare consumo alimentare dei suddetti vegetali e ridotta incidenza di manifestazioni cancerose.

Contengono l’indolo 3- carbinolo, riparatore del DNA cellulare, e carotenoidi, discreti modulatori dell’immunità innata, con cruciali pertinenze anti-androgeniche. Perché l’equilibrio ormonale è la combinazione segreta che ci libera dal rischio preliminare di sviamento di molte vie metaboliche cellulari. A monte, quindi, della degenerazione cancerosa.

Brassica oleracea e nanoparticelle di rame: cronache sperimentali

Tale studio preliminare di screening fitochimico, inizia con il reperimento delle piante dal locale mercato di Kelambakkam, Chennai, Tamil Nadu. Pulite, mediante lavaggio e rimozione delle foglie dai gambi. Poi l’asciugatura accurata, che non pregiudicasse la successiva conservazione. Quindi la polverizzazione pre-estrazione del fitocomplesso, da sottoporre alle indagini biochimiche. Al termine, i ricercatori hanno ottenuto un estratto alcolico, con due diverse procedure. Una, quella ad opera dell’estrattore Soxhlet, con l’80% di etanolo, seguita poi da due saggi: fitochimico ed antimicrobico. L’altra, che invece ha fruttato un macerato freddo, mediante agitatore rotante a 100 rpm overnight, seguita da filtrazione con carta Whatman n.1 e conservazione a 4°C.

Dopo una convenzionale analisi fitochimica, che ha rilevato alcaloidi, aminoacidi, carboidrati, fenoli, saponine, fitosteroli, flavonoidi e terpeni, i ricercatori si sono concentrati sulla produzione di nanoparticelle di rame da tale matrice vegetale.

Biosintesi di rame nanoparticellare vegetale

Gli operatori hanno, dunque, addizionato 10 mL di estratto alcolico vegetale a 90 mL di soluzione acquosa 1 mM di solfato di rame, in un pallone conico, promuovendo la riduzione di ioni rame, sotto agitazione costante per 15 minuti a 25°C. Il filtrato vegetale, quindi, ha agito da agente stabilizzante e riducente del CuSO4 1 mM. Ed il solfato di rame, ormai ridotto a ioni rame, si è poi manifestato con viraggio cromatico, da giallo chiaro a marrone scuro. La formazione di nanoparticelle di rame, invece, i ricercatori l’hanno appurata mediante analisi spettrofotometrica UV-Visibile, tra 500 e 700 nm.

Le nanoparticelle di rame hanno, successivamente, subìto centrifugazione a 10.000 rpm per 30 minuti. La risospensione del pellet, che le conteneva, in acqua deionizzata, ha allontanato eventuali ulteriori residui biologici indesiderati. Secondo analisi SEM (Scanning Electron Microscopy), le dimensioni delle nanoparticelle si sono attestate su 300-700 mn.

Saggio dell’attività antimicrobica delle nanoparticelle

Le facoltà antibatteriche dell’estratto vegetale, da cavolo nero, hanno manifestato la propria portata su agar Muller-Hinton (MHA), secondo il metodo di disco-diffusione Kirby-Bauer. I ceppi batterici coinvolti nelle prove sperimentali sono, prima, cresciuti su agar nutriente a 37°C per 24 ore. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Poi risospesi in soluzione salina allo 0.85% di NaCl. La loro densità cellulare aggiustata allo 0.5 dello standard di torbidità di MacFarland. Così la sospensione batterica ha raggiunto la concentrazione di 1.5×108 CFU/mL.

I ricercatori hanno, allora, provveduto a trasferire l’inoculo standardizzato, diffondendolo, su piastre di agar Muller-Hinton (MHA), mediante tamponi sterili. Posti poi alcuni dischi sterili di carta Whatman n.1 sulle piastre, gli operatori vi hanno caricato l’estratto etanolico vegetale grezzo e le nanoparicelle di rame a diverse concentrazioni. Per controllo, un disco antibiotico standard con 10 μg di ampicillina. Quindi, tutto in incubazione a 37°C per 1 giorno. E triplicati di ogni prova.

Zona d’inibizione e l’antibiosi è servita!

La crescita batterica interrotta, per inibizione antibiotica, ha descritto una zona franca, intorno al disco di carta preposto allo scopo. Tali zone di inibizione (Figura 2), misurate in millimetri mediante righello a pinze scorrevoli, sono state confrontate con i riferimenti standard dell’antibiotico impiegato. Di contro, l’assenza di inibizione, in altre zone della piastra, ha fornito una misura di “non attività” dell’antibiotico. Gli organismi seminati, invece, distinti in suscettibili, intermedi e resistenti, agli estratti vegetali testati.

Saggio del potenziale antimicrobico  delle nanoparticelle di rame.
Figura 2 – Estrapolazione da documentazione fotografica del saggio antimicrobico:
https://europepmc.org/article/med/33219177
25 μL estratto grezzo – 15 mm
50 μL estratto grezzo – 16 mm
25 μL nanoparticelle di rame – 14 mm
50 μL nanoparticelle di rame – 24 mm
Ampicillina (Controllo) – 14 mm

Gli esiti, dunque, parlano di inibizione prevalentemente di E. coli, S. aureus e P. aeruginosa. Ed azione anti-micotica su C. albicans. Confrontando gli effetti profusi dall’estratto grezzo di Brassica oleracea e quelli delle nanoparticelle di rame, non si può che confermare la massima antibiosi garantita dal rame.

Nanotecnologie in oncologia

Nuove terapie e tecniche anticancro fanno largo uso, ormai, delle nanotecnologie e dei nanomateriali. Per questo, in tale ultimo studio, i ricercatori hanno indagato anche le proprietà citotossiche delle nanoparticelle di rame biosintetizzate. Il test citotossico si è svolto sulla linea cellulare cancerosa HeLa, a differenti concentrazioni di estratto grezzo e nanoparticelle.

La soppressione di crescita in termini di IC₅ₒ si è configurata con i rispettivi valori:

  • 170.6622 μg/mL per l’estratto grezzo
  • 119.0805 μg/mL per le nanoparticelle di rame

rivelando, inoltre, che il tasso di tossicità cresce al crescere della concentrazione delle nanoparticelle di rame. Esse potrebbero, quindi, davvero, assurgere a nuovi agenti anticancro, in differenti protocolli sperimentali.

Il rame, in fondo, è noto da tempo immemore come antibatterico, oggi anche antineoplastico, anche più di altri metalli nobili: argento, oro. Però, proprio per il suo potenziale redox inferiore, si ossida facilmente, quando esposto all’aria. La sintesi di nanoparticelle, quindi, è sempre risultata difficoltosa, con i comuni metodi idrotermali e riduzioni termali. Per di più, i suddetti metodi sono sempre stati antieconomici e scarsamente biocompatibili, per l’impiego di solventi organici. La biosintesi green di nanoparticelle antimicrobiche ed anticancro è la strada. La migliore, almeno per ora.

Riferimenti bibliografici

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