La purificazione di una proteina dalla A alla Z

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Come si purifica una proteina?

Con purificazione di una proteina si intende la procedura biochimica volta ad estrarre una proteina dal suo compartimento cellulare e separarla da tutte le altre al fine di studiarne la struttura e il funzionamento.
Isolare una proteina non sempre risulta un’impresa semplice. A seconda, infatti, del tessuto da cui deve essere estratta, dalla quantità presente nella cellula, ma soprattutto dal grado di purezza che si vuole ottenere, i passaggi possono aumentare notevolmente. Nonostante questo, si possono individuare quattro steps fondamentali:

  1. Scelta della fonte
  2. Distruzione delle cellule e solubilizzazione delle proteine
  3. Dosaggio delle proteine
  4. Metodi di frazionamento

Scelta della fonte

Quando bisogna estrarre una proteina le prime domande che bisogna porsi sono: In quali cellule si trova? E in che quantità? Senza sapere queste due informazioni è inutile iniziare una purificazione.
Non tutte le proteine sono infatti presenti in tutti i tipi cellulari e soprattutto non tutte vengono prodotte alla stessa concentrazione. Prediamo ad esempio l’emoglobina, la proteina responsabile del trasporto dell’ossigeno. Se volessimo isolarla non potremmo mai utilizzare delle cellule provenienti dal fegato o dall’epidermide, in quanto la proteina in questi tessuti non viene nemmeno espressa. Utilizzeremmo invece le cellule del sangue formate anche da eritrociti (globuli rossi) in cui si trova un alta concentrazione di emoglobina.

Un altro aspetto interessante, quando si parla di scegliere la fonte, è la possibilità di sovra-esprimere un gene. Con le tecnologie moderne si può infatti aumentare il numero di copie di un gene, in modo tale da produrre una maggior concentrazione di proteina.
In questo caso ci si avvale spesso di cellule batteriche, come Escherichia coli, che vengono utilizzate come delle fabbriche in miniatura a cui diamo il compito di produrre la proteina. In particolare, il gene di interesse viene inserito nei vettori di espressione, come ad esempio i plasmidi, i quali vengono fatti assorbire dalle cellule per trasformazione.

Distruzione delle cellule e solubilizzazione delle proteine

Qualsiasi sia la fonte scelta, affinché si possa estrarre una proteina, la cellula deve essere distrutta.
I metodi di distruzione delle cellule sono molteplici, ma possiamo distinguerli convenzionalmente in metodi meccanici e metodi chimici.
Tra i metodi meccanici il più utilizzato è sicuramente la sonicazione, tecnica che consiste nell’esporre le cellule agli ultrasuoni al fine di provocare la rottura delle membrane biologiche.
Altri metodi meccanici prevedono l’utilizzo di frullatori, omogeneizzatori o presse.

Tra i metodi chimici invece troviamo l’utilizzo del lisozima per rompere le pareti batteriche, lo shock osmotico, congelamento seguito da successivo scongelamento e utilizzo di detergenti che dissolvono la membrana cellulare.

Qualsiasi sia il metodo scelto, è importante che alla distruzione cellulare segua la solubilizzazione delle proteine mediante utilizzo di opportuni tamponi. Lo scopo è quello di preservare l’integrità delle proteine che altrimenti si troverebbero esposte ad agenti chimici o pH non ottimali.

Dosaggio delle proteine

Con dosaggio delle proteine si intende la misura della concentrazione proteica del nostro campione. Questo step riguarda sia le proteine totali sia la proteina di interesse.
I metodi per dosare le proteine si basano principalmente su tecniche spettrofotometriche che possono dividersi in due categorie: le tecniche dirette e le tecniche indirette (colorimetriche). Le tecniche dirette si basano sulla presenza di residui amminoacidici aromatici, capaci di assorbire la luce ad una lunghezza d’onda di circa 280 nm, le tecniche indirette invece si avvalgono di coloranti la cui funzione è quella di legarsi alle proteine ed assorbire la luce. In entrambi i casi, l’assorbanza misurata viene correlata alla concentrazione di proteine presenti nel campione mediante la legge di Lambert-Beer.

Il grafico mostra la correlazione tra assorbanza e concentrazione: all’aumentare dell’assorbanza aumenta anche la concentrazione di proteine presenti nel campione.
Figura 1 – Il grafico mostra la correlazione tra assorbanza e concentrazione: all’aumentare dell’assorbanza aumenta anche la concentrazione di proteine presenti nel campione.

Metodi di frazionamento

Arriviamo finalmente alla parte più complessa ed importante della purificazione: attuare una strategia che ci consenta, passaggio dopo passaggio, di isolare la nostra proteina. Di seguito verranno elencate tre tecniche indipendenti che, sfruttando le caratteristiche chimico-fisiche delle proteine, ci permettono di ottenere una generica proteina purificata.

Frazionamento con sale d’ammonio

Questa prima tecnica sfrutta la diversa solubilità delle proteine in presenza di un sale.
In generale, al crescere della concentrazione salina, la solubilità delle proteine tende a diminuire con conseguente precipitazione. Questo fenomeno, chiamato salting out, viene spiegato dal fatto che, ad alte concentrazioni, il sale entra in competizione con le proteine per le molecole d’acqua. Le proteine private quindi dello strato di idratazione interagiscono tra di loro mediante i residui idrofobici ed escono dallo stato di soluzione.
Proteine con più residui idrofobici precipiteranno a concentrazioni di sale più basse rispetto a proteine con più residui idrofilici.

Il grafico mostra l’andamento della solubilità in funzione della forza ionica. La solubilità raggiunge un picco massimo a bassa forza ioniche mentre tende a diminuire per elevati valori di forza ionica.
Figura 2 – Il grafico mostra l’andamento della solubilità in funzione della forza ionica. La solubilità raggiunge un picco massimo a bassa forza ioniche mentre tende a diminuire per elevati valori di forza ionica.

Il sale più utilizzato a questo scopo è il solfato d’ammonio ((NH₄)₂SO₄) che viene aggiunto a concentrazione crescente in diverse provette che contengono la stessa aliquota di campione.
Attraverso poi ulteriori analisi, ad esempio tramite una misura dell’attività enzimatica, è possibile osservare il comportamento della proteina di interesse nelle diverse provette. Si vede dunque a che concentrazione di solfato d’ammonio la proteina si è sedimentata (pellet) e a che concentrazione si trova ancora nella fase liquida (supernatante).
Attraverso due passaggi si prende dunque dapprima il pellet dalla provetta in cui la proteina è precipitata e poi il supernatante dalla provetta in cui è rimasta in soluzione. In questo modo, siamo riusciti ad ottenere una prima grossolana purificazione.

Dialisi

Prima di poter passare al secondo metodo di frazionamento, occore operare uno step accessorio che consiste nell’eliminazione del solfato d’ammonio attraverso la dialisi. La dialisi è una tecnica di filtrazione che permette di separare due soluti grazie alla presenza di una membrana semipermeabile.

Figura 3 – La figura mostra una generica filtrazione per dialisi. Le proteine contenenti solfato d’ammonio vengono messe in un sacchetto da dialisi e poi immerse nel tampone. Poiché la membrana del sacchetto è semipermeabile, il sale si distribuirà egualmente tra il sacchetto ed il tampone.
Frazionamento per denaturazione

Normalmente le proteine tendono a denaturare alle alte temperature, ovvero perdono la loro struttura tridimensionale esponendo residui idrofobici che altrimenti rimarrebbero nascosti nel core proteico. Una proteina con i residui idrofobici esposti tenderà a risultare “appiccicosa” e formerà aggregati con le altre proteine.
Questo processo può essere sfruttato nella purificazione soprattutto nel caso particolare in cui la proteina da isolare sia termostabile. Aumentando dunque la temperatura e poi centrifugando otteniamo una soluzione in cui gran parte delle proteine, quelle più sensibili al calore, sono state eliminate.

Tecniche cromatografiche

Le tecniche cromatografiche sono sicuramente tra le tecniche più efficaci per effettuare una purificazione. Ne esistono di vari tipi ma si basano tutte sull’interazione del nostro campione con due componenti distinte: una fase stazionaria e una fase mobile. La fase mobile, un liquido o un gas, viene fatta scorrere insieme al nostro campione attraverso una colonna contenente la fase stazionaria, un solido o un liquido.
La fase mobile trascinerà con sé le proteine verso l’uscita della colonna, ma proteine differenti verranno ritardate in modo diverso a seconda dell’interazione che hanno con la matrice.
Solitamente si sceglie una fase stazionaria che interagisce meglio con la proteina di interesse di modo che ad uscire per prime saranno le molecole da scartare.

Vediamo ora alcune tecniche cromatografiche, classificate in base alle interazioni che si formano tra proteine e fase stazionaria:

  • Cromatografia a scambio ionico: si basa sull’attrazione tra molecole di carica opposta.
  • Cromatografia ad adsorbimento: si basa sulla formazione di legami deboli tra i residui idrofobici delle proteine e la fase stazionaria.
  • Cromatografia ad esclusione molecolare: si basa sulle dimensioni delle proteine. Le proteine con dimensioni minori verranno rallentate dalla fase stazionaria ed usciranno per ultime.
  • Cromatografia per affinità: si basa sulla formazione di legami specifici tra proteine e fase stazionaria, ad esempio un legame formato da proteina e anticorpo.

Fonti

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