Test di germinazione per la valutazione della fitotossicità

Contesto

Come per il test respirometrico, il test di germinazione rappresenta una prova fondamentale per la valutazione della stabilizzazione della materia organica nei processi di compostaggio.

Il compost, gli ammendanti ed altre matrici organiche sono un’importante risorsa in ambito agronomico e nell’ambito dell’economia circolare. Queste matrici devono però subire un processo di stabilizzazione prima di poter essere impiegate in agricoltura, evitando così che possano influenzare negativamente le colture.

Risulta quindi fondamentale assicurarsi che tutte le fasi del processo di compostaggio si svolgano in maniera corretta al fine di evitare danni all’ambiente e alla salute.

Infatti durante le prime fasi di biodegradazione della materia organica si assiste all’accumulo di metaboliti che potrebbero risultare tossici nei confronti delle piante (fitotossine). Col passare del tempo queste vengono progressivamente metabolizzate dai microrganismi nella loro attività di biodegradazione e diminuiscono fino alla completa stabilizzazione della biomassa.

La presenza di queste fitotossine è dovuta a diversi fattori e la loro determinazione chimica si presenta complessa. Per questi motivi risulta più semplice valutare la fitotossicità di una matrice organica attraverso l’utilizzo di test biologici, come ad esempio il test di germinazione.

Test di germinazione: organismo test

Il test di germinazione si avvale della specie Lepidium sativum (Fig. 1), pianta comunemente nota come crescione inglese, per testare gli effetti fitotossici di un dato substrato.

Lepidium sativum, specie test per il test di germinazione. Semi (a sinistra), giovani plantule (al centro) e pianta adulta (a destra)
Figura 1 – Lepidium sativum, specie test per il test di germinazione. Semi (a sinistra), giovani plantule (al centro) e pianta adulta (a destra) [Fonte: www.wikimedia.org e www.istockphoto.com].

L. sativum è una pianta erbacea aromatica annuale di piccole dimensioni (20 – 60 cm ca.) appartenente alla famiglia delle Brassicaceae. Pianta di probabile origine africana (Egitto, Etiopia) e Medio orientale, viene coltivata sin dal Medioevo per uso alimentare e medicinale.

Data la sua facilità di coltivazione e la sua rapidità di germinazione (24 ore), questa pianta rappresenta la specie ideale da utilizzare nel test di germinazione.

Esecuzione del test di germinazione

Il principio su cui si basa il test di germinazione è molto semplice: valutare l’entità dell’effetto fitotossico del campione sulla germinazione dei semi di L. sativum, ovvero sull’accrescimento della radice primaria.

Si esegue il test su 200 g di campione che vengono portati ad un tenore di umidità dell’85% e lasciati a riposare per due ore a contatto con l’acqua aggiunta.

A questo punto si preapara un estratto acquoso sottoponendo il campione ad una serie di passaggi di chiarificazione. Il campione viene dapprima centrifugato a 6000 giri al minuto per 15 minuti ed il surnatante viene filtrato tramite una membrana con porosità di 0.8 μm ad una pressione di 3.5 atm.

Si diluisce quindi l’estratto acquoso risultante fino a ottenere una concentrazione del 50% e una del 75%. Queste rappresentano le concentrazioni di campione da sottoporre al test di germinazione.

Si preparano 3 serie da 5 capsule petri da 90 mm contenenti carta bibula. Due serie rappresentano le due concentrazioni del campione al 50% ed al 75%, la terza rappresenta il testimone (acqua distillata). Si prelevano quindi 5 ml di ciascuna delle due concentrazioni del campione suddividendole in aliquote di 1 ml per capsula petri. Il testimone si prepara analogamente utilizzando acqua distillata.

In ciascuna petri si dispongono 10 semi di L. sativum (Fig. 2A) fatti precedentemente ringofiare in acqua distillata per un’ora.

Capsula petri contenente 10 semi di L. sativum per l'esecuzione del test di germinazione (A) ed allungamento radicale, tra frecce, in fase di germinazione (B)
Figura 2 – Capsula petri contenente 10 semi di L. sativum per l’esecuzione del test di germinazione (A) ed allungamento radicale, tra frecce, in fase di germinazione (B) [Fonte: immagine personale].

Le capsule vengono quindi poste in incubazione ad una temperatura di 27 °C per un periodo di 24 ore. Al termine del periodo di incubazione si determinano il numero di semi germinati e la lunghezza della radice primaria di ogni singolo seme germinato (Fig. 2B).

Calcolo ed espressione del risultato

Per ciascuna delle concentrazioni sottoposte al test (50% e 75%) si determina l’indice di germinazione in percentuale (Ig50% e Ig75%) mediante la seguente formula:

Ig(50 o 75)% = (Gc x Lc)/(Gt x Lt) x 100

Dove:

  • Gc: n° medio di semi germinati nel campione
  • Gt: n° medio di semi germinati nel testimone
  • Lc: lunghezza radicale media nel campione
  • Lt: lunghezza radicale media nel testimone

L’indice di germinazione (Ig%) è dato dalla media dei valori degli indici alle due concentrazioni sottoposte al test.

Sebbene il calcolo dell’indice si basi di norma sulle due concentrazioni di cui sopra, esso può anche essere ricavato saggiando concentrazioni differenti.

Interpretazione ed aspetti normativi

Il test di germinazione rappresenta uno strumento utile alla conoscenza dello stato di stabilità biologica di una data biomassa.

Più il valore dell’indice è basso, più è alta la concentrazione di fitotossine. Queste tendono ad accumularsi nelle prime fasi di decomposizione della materia organica e diminuiscono progressivamente e parallelamente alla riduzione dell’intensità di biodegradazione. Una matrice organica matura e stabile presenta quindi un basso livello di componenti fitotossiche.

Substrati come il compost devono presentare un certo grado di stabilità biologica ai fini del loro impiego in agricoltura come ammendanti o concimi.

A livello nazionale il D.lgs 75/2010 disciplina e stabilisce i criteri di ammissibilità delle differenti matrici organiche per il loro utilizzo come fertilizzanti in agricoltura. Il decreto legge considera ammissibili quelle matrici che sottoposte al test diano un valore di indice maggiore o uguale al 60% ad una concentrazione del campione pari al 30%.

Il test di germinazione rappresenta quindi uno strumento fondamentale per la corretta gestione delle frazioni organiche dei rifiuti consentendo il loro impiego come fertilizzanti.

Bibliografia

Crediti immagini

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Francesco Raimondi

Intraprendo la carriera di biologo presso l'Università di Bologna conseguendo la laurea magistrale in Biodiversità ed Evoluzione. Proseguo gli studi specializzandomi nel settore ambientale tramite il Master di II livello " Caratterizzazione e risanamento di siti contaminati" presso Cà Foscari Challenge School. Attualmente lavoro come specialista in microbiologia presso un laboratorio di analisi ambientali a Bologna e faccio parte del comitato scientifico di Wildlife Initiative, associazione attiva nel campo del conservazione.

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