Lievito per birrificazione: guida pratica per il riutilizzo (seconda parte)

Condividi l'articolo di Microbiologia Italia:

La seconda parte della breve guida pratica per il recupero e il riutilizzo del lievito si sofferma sugli aspetti fondamentali delle operazioni manuali di recupero e conteggio delle cellule vive, introducendo elementi di calcolo applicabili ad esempi reali quivi rappresentati.

Leggi la prima parte di questo articolo.

Recupero

E’ doveroso anzitutto specificare che per questa operazione va necessariamente considerata la finestra temporale idonea per assicurare una buona riuscita del riutilizzo: infatti, il lievito va recuperato in un momento preciso dopo la fermentazione, in quanto, se così non fosse, si rischia di applicare una selezione su base genetica. Le cellule presenti in superficie (top cropping) sono quelle più giovani, dunque con maggiore vigoria e attenuazione (percentuale di consumo dei saccaridi) nettamente superiori a quelle presenti nella restante parte del fermentatore; al contrario, le cellule presenti sul fondo risultano essere le prime a depositarsi dopo aver completato il metabolismo e aver flocculato, dunque c’è una maggiore probabilità di incappare in cellule morte miste a residui vegetali dovuti ad esempio a luppolo (specialmente se si effettua dry hopping, ovvero luppolatura post-bollitura).

Ipotizzando di avere un fermentatore tronco-conico, ovvero il più diffuso nei piccoli e grandi birrifici, possiamo assumere che, tramite il rubinetto di scarico parziale (posto solitamente di fianco al totale), si effettua il prelievo esattamente dopo la fase krausen, ovvero il picco dell’attività fermentativa, dopo aver abbassato la temperatura nel tank a 2°C assicurando un’adeguata flocculazione delle cellule. Assicurando le condizioni di sterilità adeguate, con l’ausilio di sanificanti specifici (es. alcol in sali quaternari) da applicare sui rubinetti, è consigliabile eliminare il primo materiale espulso (c’è una buona probabilità che vi siano impurezze e cellule morte) fino a quando non si ottiene una crema omogenea. Da qui, il conteggio delle cellule vive darà risposta quantitativa alla domanda di lievito da recuperare per la prossima produzione.

Campione lievito conta cellulare
Figura 1 – è sufficiente un piccolo quantitativo di lievito campione per il conteggio delle cellule vive [Fonte: Marco Cozzolino]

Pianificazione

Il lievito recuperato mantiene orientativamente la medesima vitalità a temperature di refrigerazione per una settimana (sebbene allo scadere di questa si rischia un abbassamento del potere fermentativo), dunque è fondamentale pianificare controllo qualità, conseguente conta cellulare e stoccaggio basati sui ritmi di produzione e sull’organizzazione interna; il congelamento e conseguente decongelamento causano forte perdita di liquidi cellulari (a meno di costosi sistemi di raffreddamento con azoto liquido e/o crioprotettori).

Dopo la 4-5 generazione, si consiglia fortemente anche un altro tipo di analisi: con l’aiuto di terreno con TTC in piastra osserviamo il numero di cellule vive per comprendere quante cellule ancora respirano e hanno capacità metaboliche. Chi scrive sconsiglia il travaso fondo-fondo per un controllo qualità; la resistenza all’alcol è in genere ceppo-dipendente, ma è certo che un lievito reinoculato nella medesima birra (stesso grado plato, stessa luppolatura, ecc) avrà pochissime cellule morte.

Diluizioni

Molto spesso risulta difficile, se non del tutto impossibile, contare le cellule direttamente al vetrino a causa della grande densità di cellule specialmente in birra giovane. Ci serviamo dunque delle diluizioni, che dovrebbero metterci nelle condizioni tali da avere un numero di cellule che varia da 30 a 100 per quadratino della camera di conta (per birra giovane si consiglia 1/50, per campioni di lievito anche 1/100): è possibile utilizzare acqua sterile da laboratorio, anche se, per garantire la corretta procedura e mantenere inalterato lo stato di salute delle cellule, si consiglia vivamente l’uso della soluzione fisiologica 0.9% (in sostituzione acqua peptonata tamponata o Ringer).

Dopo aver effettuato la diluizione, si consiglia il trasferimento di un’aliquota in microprovetta tipo Eppendorf in modo da poter aggiungere, in parti uguali in modo da avere diluizione semplice, il blu di metilene allo 0,1%: questo colorante penetrerà nelle cellule anziane e morte (dunque avremo anche una stima approssimativa della c.d. vitality). Il lievito prelevato dallo slurry (la crema presente nel fermentatore) va sempre pesato e mai preso in volume, in quanto per la natura fisica della crema si ingloba sempre una parte di aria, per cui falseremo la diluizione se preleviamo 1mL anziché 1g.

Conta cellulare

Lo strumento in nostro supporto è senza dubbi il microscopio ottico in campo chiaro, con ingrandimento 40x o 100x (in commercio sono reperibili telecamere installabili sull’alloggio fotografico che i moderni microscopi possiedono di default, che hanno un ulteriore potere di ingrandimento e che permettono una visualizzazione comoda da PC).

Sotto la lente in questo caso poniamo la camera di conta (Thoma o Burker), ovvero un citometro aventi 4×4 quadratini ognuno con lato l=0.2mm con dimensioni totali A=0.0025mm² e V=0.00025mm³; ogni quadratino ha due triple righe che servono a delimitare l’area di competenza dello stesso (volendo usare un’espressione in prestito dallo sport: linea fa campo, dunque la tripla riga demarca lo spazio da assegnare al quadratino comprendente le cellule).

Dov’è presente la tripla riga, il margine di proprietà (ovvero quello sul quale si poggia, in via del tutto casuale, una o più cellule da conteggiare) è la linea di mezzo; al contrario ci riferiamo al margine interno. Conteremo dunque cellule vive e morte in minimo 4 quadratini (per convenzione) equamente distribuiti sulla rete della camera, tale da avere una stima su almeno 100-150 cellule (tenere sempre d’occhio la distribuzione casuale delle cellule vive e morte, la coerenza dei dati è estremamente importante). E’ chiaro che un numero maggiore di quadratini considerati darà un’accuratezza statistica maggiore.

Camera Thoma lievito
Figura 2: camera di Thoma con cellule di lievito al microscopio [Fonte: Marco Cozzolino]

Calcoliamo dunque la media di cellule vive e morte:

  • % vive = [media cellule vive / (media cellule vive + media cellule morte)] x 100 si consiglia un recupero solo se questo dato è >85%
  • cellule vive nello slurry / g = media cellule vive x fattore di diluizione x fattore moltiplicativo della camera (es 250000, indicato su confezione)

Il fattore di diluizione deve necessariamente tener conto dell’aggiunta di blu di metilene in soluzione, che diluisce ulteriormente il campione.

Inoculo

Ipotizziamo quindi di avere 100L di mosto di birra a 12°P; volendo fermentare con lievito ale recuperato da precedente cotta, quante cellule vive dovremo inoculare?

PITCHRATEALELAGER
MINIMO0.5 milioni1 milione
MASSIMO1 milione2 milioni
Tabella 1: tassi di inoculo o pitchrate consigliati per birre ale e lager

Inoculo del lievito riutilizzato = pitchrate x mL x °P

A questo punto, sapendo il numero di cellule da inoculare, resta da sapere quanto slurry o crema di lievito dovremo prendere dal fermentatore iniziale e introdurre nel tank successivo:

Inoculo / (cellule vive nello slurry / g) = g di slurry

recupero slurry
Figura 3 – lievito recuperato in fermentatore di plastica sanificato [Fonte: Marco Cozzolino]

Considerazioni finali

Recuperare il lievito, per birrai alle prime armi, homebrewers e piccoli birrifici non dotati di laboratorio o strumentazioni di base per il controllo, può risultare un’operazione ardua. Vecchie regole spannometriche indicavano 0.5 litri di crema / hL e questo ha aiutato non poco nella praticità e nella gestione delle operazioni quei professionisti che non dispongono di strumentazioni e conoscenze adeguate; per un birrificio che intende effettuare operazioni di questo tipo stabilmente e con un certo grado di sicurezza, le procedure illustrare in questi due articoli diventano prioritarie e imprescindibili.

Fattori come grado alcolico elevato e carenze del mosto possono peggiorare lo stato di salute del lievito, quindi è doveroso affermare che ogni birra, così come concepita dal birraio che la progetta, costituisce habitat a sé e solo l’analisi e la sperimentazione possono fornire risposte adeguate, sebbene sia ormai consolidato il fatto che birre con grado alcolico superiore all’8% v/v abbassano la vitalità al di sotto del valore soglia dell’85%, così come è risaputo che a temperature di refrigerazione la viability diminuisce molto meno velocemente della vitality (numero di cellule morte e vitalità, rispettivamente).

Il rispetto delle tempistiche di recupero assicurerà una stima precisa e una buona vitalità delle cellule senza dover ricorrere a lavaggi acidi dello slurry per eliminazione di cellule morte; inoltre, l’assenza di queste ultime garantisce un profilo organolettico eccellente della birra finita, privo quindi di fenomeni indesiderati come autolisi.

Fonti

  • Loveridge, D., Ruddlesden, J.D., Noble, C.S. and Quain, D.E. (​1999) Improvements in brewery fermentation performance by ‘early’ yeast cropping and reduced yeast storage time
  • Chris D. Powell, David E. Quain, Katherine A. Smart (2003) The impact of brewing yeast cell age on fermentation performance, attenuation and focculation
  • Smart, K.A. and Whisker, S.W. (1996) Effect of serial repitching on the fermentation properties and condition of brewing yeast

Condividi l'articolo di Microbiologia Italia:

Lascia un commento