Microscopio ottico: che cos'è e come funziona (prima parte)

Il microscopio ottico come strumento indispensabile

L’osservazione e lo studio delle caratteristiche morfologiche di microrganismi e cellule si basa sull’analisi al microscopio. Le loro dimensioni infatti (a parte alcuni casi particolari) sono inferiori alla capacità visiva dell’occhio umano.

Ecco perchè è necessario possedere uno strumento che potenzi la nostra vista e ci permetta di guardare da vicino il mondo microbiologico, un mondo estremamente diversificato, nel quale siamo completamente immersi in ogni momento ma che tuttavia sfugge alla portata dei nostri sensi (Fig.1).

scala di grandezza e relativa capacità visiva degli strumenti utilizzati in microscopia — *Figura 1 – Scala di grandezze e conseguente potere di risoluzione dell’occhio umano e degli strumenti utilizzati in microscopia*. A cosa serve il microscopio? ad osservare gli oggetti che l’occhio umano non raggiunge

La storia della microscopia inizia con Galileo Galilei

Il microscopio ottico ha una storia lunga che comincia con le ricerche di Galileo Galilei (1564-1642). Fu il primo scienziato ad occuparsi di lenti e di sistemi ottici capaci di ingrandire gli oggetti per metterne in evidenza dettagli altrimenti invisibili all’occhio umano.

Furono tuttavia due suoi contemporanei, l’italiano Francesco Stelluti e l’olandese Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723), i primi ad avere l’idea di utilizzare gli strumenti creati da Galileo per osservare i microrganismi, gettando così le basi dell’odierna microscopia ottica (per approfondire al riguardo, si rinvia al nostro articolo).

Il progresso tecnologico ha portato nel corso del tempo alla nascita di diversi tipi di microscopio. Accanto al tradizionale microscopio ottico, che si basa sull’uso di lenti per focalizzare ed indirizzare la luce visibile, sono nati cosi’ strumenti che sfruttano invece fasci di elettroni quali sorgente di luce. E’ il caso ad esempio del microscopio elettronico a scansione (SEM) e del microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Il microscopio ottico e elettronico sono due strumenti che oggi sono di fondamentale importanza per la microscopia moderna.

Il microscopio come strumento d’elezione nella diagnostica

Nonostante questi ultimi siano tanto potenti da permettere di osservare componenti persino più piccoli della cellula o dei suoi organelli, avendo una risoluzione che può scendere a livello molecolare, il microscopio ottico resta tutt’ora lo strumento principale tanto nella diagnostica clinica quanto negli studi classici d’individuazione, di tassonomia e di classificazione dei microrganismi.

Esso infatti non solo presenta costi nettamente più bassi rispetto ai microscopi elettronici, ma risulta anche di più semplice utilizzo (laddove SEM e TEM necessitano invece di essere maneggiati da personale adeguatamente preparato e certificato, data la loro complessità). E’ insomma uno strumento più agile e versatile, le cui tecniche possono essere apprese facilmente da professionisti diversi (biologi, medici, tecnici di laboratorio e chimici).

La preparazione dei campioni che devono essere sottoposti all’analisi al microscopio elettronico richiede inoltre tecniche raffinate e complesse, tutte quante distruttive per gli stessi. Il microscopio ottico invece permette di preservare maggiormente l’integrità strutturale del campione, consentendo ad esempio l’osservazione in vivo di cellule e microrganismi (su quest’ultimo punto è tuttavia necessario fare un doveroso chiarimento e vi torneremo nel paragrafo intitolato: “Osservare al microscopio”).

Infine, escluso il caso della ricerca di base, per la maggior parte delle applicazioni pratiche e cliniche in ambito microbiologico le conoscenze fornite dalle tecniche di microscopia ottica bastano ed avanzano per studiare i microrganismi, tanto nel loro habitat quanto nella loro interazione con l’organismo umano.

Come funziona il microscopio ottico

Avendo intenzione di redigere un articolo consultativo, in questo paragrafo eviteremo di scendere troppo nel dettaglio dei principi fisici e delle leggi dell’ottica, puntando soprattutto a dare una visione il più possibile pratica di come funziona lo strumento.

Il microscopio ottico utilizza un sistema di lenti capaci di raccogliere, indirizzare e focalizzare i raggi di luce emessi da una sorgente così da produrre un’immagine ingrandita di oggetti molto piccoli.

La luce utilizzata è dello spettro del visibile e comprende pertanto le lunghezze d’onda percepibili all’occhio umano (dai 390 ai 700 nm circa).

I microscopi moderni sono tutti strumenti composti: l’immagine ingrandita che si forma attraverso le lenti dell’obiettivo viene cioè ulteriormente amplificata per mezzo di una o più lenti aggiuntive. Di seguito si possono osservare le parti del microscopio e come queste lo compongono (Fig.2).

Il sistema d'illuminazione è costituito da una sorgente luminosa, che illumina il campione posizionato sul vetrino e da un condensatore che fa convergere la luce su quest'ultimo. L'apparato ottico è rappresentato invece da due sistemi di lenti (lenti dell'obiettivo e lenti dell'oculare). L'immagine viene quindi ingrandita dapprima dalle lenti dell'obiettivo, quindi da quelle dell'oculare: l'ingrandimento totale è pertanto il prodotto dei due diversi ingrandimenti. — Figura 2 – **Un disegno del microscopio ottico**: Il sistema d’illuminazione è costituito da una sorgente luminosa, che illumina il campione posizionato sul vetrino e da un condensatore che fa convergere la luce su quest’ultimo. L’apparato ottico è rappresentato invece da due sistemi di lenti (lenti dell’obiettivo e lenti dell’oculare). L’immagine viene quindi ingrandita dapprima dalle lenti dell’obiettivo, quindi da quelle dell’oculare: l’ingrandimento totale è pertanto il prodotto dei due diversi ingrandimenti.

Il potere di risoluzione del microscopio ottico

Nonostante ci siamo prefissati di non scendere troppo nel dettaglio quanto alle leggi della Fisica che soggiacciono al funzionamento dello strumento, è necessario comunque chiarire l’importanza del potere di risoluzione del microscopio rispetto all’occhio umano.

Il potere di risoluzione non va confuso con l’ingrandimento di un oggetto. Esso è infatti la capacità di distinguere visivamente due punti vicini come separati (equivalentemente, la minima distanza al di sotto della quale due punti ravvicinati vengono visti come uno solo).

Quello dell’occhio umano è di circa 0,1 mm (100 micrometri): ciò significa che se due oggetti sono ad una distanza minore, noi non siamo più capaci di distinguerli entrambi ma ne vedremo uno solo.

I limiti fisiologici dei nostri occhi sono molto importanti, quando si esplora il mondo di oggetti piccoli come i microrganismi e le cellule.

Il microscopio ottico ha un potere di risoluzione di 0,2 micrometri (200 nanometri): esso ci permette cioè di amplificare il nostro normale potere di risoluzione di circa 500 volte. Di contro, ciò significa tuttavia che non potremo distinguere chiaramente ciò che si trova sotto questa distanza. Questo limite è determinato dal mezzo che si usa per illuminare l’oggetto: la luce bianca.

Il potere di risoluzione del microscopio ottico è infatti proporzionale alla lunghezza d’onda della luce. Tuttavia esso risulta più che sufficiente per permetterci di osservare batteri, funghi, cellule umane e protozoi (ma non i virus, che hanno appunto dimensioni al di sotto di questo limite).

Com’è fatto un microscopio ottico

In generale un classico microscopio ottico ha una struttura di base simile a quella riportata di seguito (Fig.3).

*Figura 3 – Un tipico microscopio ottico. Ognuna delle sue componenti è qui indicata da un numero che ci servirà come riferimento visivo tra poco.*

Vediamone ora insieme le varie parti del microscopio ottico:

Tubo per la fotografia (opzionale): connette l’oculare ad una macchina fotografica, laddove si desideri acquisire l’immagine;
Oculari: permettono l’osservazione del campione. Alcuni modelli ne hanno uno soltanto;
Stativo: basamento del microscopio, ne sostiene tutta la struttura;
Revolver: è una semisfera rotabile dotata di tre diversi obiettivi, corrispondenti a tre diversi livelli d’ingrandimento, quello minimo (10x), quello intermedio (40x) ed infine il massimo consentito (100x);
Tavolino porta oggetti: è dove viene posto il campione da osservare dopo essere stato adeguatamente sistemato su un apposito vetrino. Spesso dispone anche di una o più pinze per tenere fermo il vetrino;
Condensatore (del quale si è già parlato);
Manopole di messa a fuoco: il livello di messa a fuoco avviene variando la distanza tra vetrino col campione ed obiettivo proprio grazie ad esse. Sono di due tipi (macrometrica, la più grande e micrometrica l’altra);
Sorgente di luce

Esistono vari modelli di microscopio ottico in commercio, differenti quanto a numero di oculari, livello d’ingrandimento (alcuni hanno anche più di tre obiettivi nel revolver), accessori inclusi e prestazioni garantite.

Ovviamente più i fini che si prefigge il microscopista richiedono precisione ed informazione, più lo strumento necessario sarà infatti complesso.

Osservare al microscopio

Il campione che si desidera osservare viene posto su un vetrino rettangolare, coperto con l’apposito vetrino copri oggetti ed infine fissato al tavolino del microscopio tramite la pinza.

Ogni microscopio è dotato di livelli diversi d’ingrandimento che permettono di scendere sempre più nel dettaglio dei particolari dell’oggetto analizzato.

Questa possibilità è garantita dagli obiettivi regolabili che fanno parte del revolver, dei quali abbiamo parlato nel paragrafo precedente.

L’ingrandimento minimo (10x) ad esempio permette di avere una visione d’insieme dell’intero campione; quello immediatamente superiore (40x) è invece utilizzato per osservarne la struttura generale (e risulta inoltre il migliore per microrganismi di grandi dimensioni, parassiti e funghi filamentosi).

L’ingrandimento massimo infine (100x) permette di studiare singoli dettagli morfologici (oltre ad essere quello d’elezione per lieviti, le cellule umane laddove si voglia studiarne eventuali anomalie interne, nonchè ovviamente per i batteri più piccoli).

Un esempio di obiettivi del microscopio ottico le cui caratteristiche determinano l'ingrandimento e la risoluzione del microscopio stesso — *Figura 4 – Un esempio di obiettivi del microscopio ottic*o *le cui caratteristiche determinano l’ingrandimento e la risoluzione del microscopio stesso*

Alcuni piccoli consigli di microscopia

Oltre a variare gli obiettivi del revolver, è buona pratica ovviamente anche muovere il vetrino e non soffermarsi mai su un unico punto del campione durante l’osservazione, così da esaminarlo per intero: quello che si sta cercando o che ci si aspetta infatti potrebbe non essere esattamente al centro o di fronte all’osservatore ma magari sui bordi (e nelle loro immediate vicinanze).

Trascurare questo aspetto è un errore che a volte può costare caro, si rischia di gettare via un campione valido solo perchè non si è avuta l’accortezza di esaminarlo in ogni sua parte.

Bisogna sottolineare che il microscopio non permette semplicemente la visione ingrandita della cellula o del microrganismo com’è in realtà: quello che si osserva è infatti sempre il risultato dell’interazione fra lo strumento e l’oggetto reale, il quale ha spesso anche subito dei trattamenti prima dell’osservazione (come avviene nel caso delle colorazioni).

Sono quindi possibili degli artefatti dovute a tali manipolazioni: in tal caso sarà la bravura del microscopista, insieme alla consultazione della letteratura scientifica sull’argomento, a fare la differenza.

La microscopia infatti non è solo una scienza ma anche un’arte, un’arte nella quale la manualità dell’operatore gioca un ruolo fondamentale tanto quanto la pratica continua, l’esperienza accumulata nel corso di osservazioni ed osservazioni, la volontà di studiare ed apprendere sempre cose nuove e diverse sull’argomento.

E’ un campo vastissimo ma affascinante: microscopisti insomma non si nasce ma si diventa, nel corso di una formazione continua che dura anni ed anni.

Oli per immersione

Quando si utilizzano gli obiettivi del revolver a più alta risoluzione (40x e 100x) spesso è opportuno migliorarne la risoluzione attraverso l’uso dei cosiddetti “oli per immersione”.

Si tratta di sostanze sintetiche oleose, a volte di origine vegetale o minerale, che eliminano quasi completamente le deviazioni (dispersione) cui sono soggetti i raggi di luce impattando sul campione, aumentando così notevolmente l’efficacia delle lenti.

Esse vengono interposte tra il vetrino copri oggetti e la lente dell’obiettivo del revolver (ne basta una goccia soltanto) ma richiedono dimestichezza per essere utilizzati, perchè si può rischiare di rovinare l’obiettivo.

Inoltre è buona norma pulire la lente dello stesso con un panno di cotone e non lasciarvi mai seccare l’olio sopra.

Microscopia in campo chiaro, in contrasto di fase e in campo scuro

In microscopia ottica si utilizzano quattro tecniche principali: la microscopia in campo chiaro, la microscopia a campo scuro, quella a contrasto di fase ed infine quella a fluorescenza (quest’ultima tuttavia richiede una sorgente di luce che sfrutta soltanto particolari lunghezze d’onda e verrà approfondita nella seconda parte di questo articolo).

La microscopia in campo chiaro è quella in cui lo sfondo su cui appare il campione (colorato o meno che sia) appare luminoso ed uniforme: si tratta della tecnica di sicuro maggiormente conosciuta anche al grande pubblico.

In essa il campione risalta per contrasto di forma e colore rispetto ad uno sfondo atono.

A volte tuttavia si rende necessario osservare i campioni inducendo un contrasto diverso rispetto allo sfondo, perchè alcuni microrganismi presentano caratteristiche morfologiche che si apprezzano maggiormente in tali condizioni oppure risultano difficili da colorare.

E’ a questo fine che sono state realizzate tecniche quali la microscopia in contrasto di fase o quella in campo scuro: il microscopio che si utilizza ha la stessa struttura già mostrata e differisce solo per la presenza di sistemi aggiuntivi di filtri, interposti tra le lenti e la sorgente, che inducono un opportuno sfasamento nei raggi luminosi.

Ma di tutto questo parleremo meglio nella seconda parte di quest’articolo.

La seconda parte dell’articolo tratterà delle diverse tecniche di microscopia ottica (campo scuro, contrasto di fase e fluorescenza), nonché dei principi alla base delle colorazioni dei campioni. Leggi anche le varie fasi di allestimento di un campione.

Letture consigliate

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Fonti

Nicola Carlone, Raffaello Pompei. Microbiologia Farmaceutica. Napoli: edizioni Edises, 2013
Lansing M. Prescott John (ed altri) Microbiologia. Bologna:edizioni Zanichelli, 2005