Tecniche di microscopia ottica: uno sguardo d’insieme

La prima parte di questo articolo, che tratta del microscopio ottico e delle tecniche di microscopia ottica in campo chiaro, è consultabile al presente link.

Lo sfondo del vetrino come termine di contrasto

Esistono diverse tecniche di microscopia ottica, ma tutte quante si basano in definitiva sul principio del contrasto di forma o colore dei microrganismi rispetto allo sfondo uniforme di superficie. Come abbiamo avuto di modo di vedere nella prima parte di questo articolo, la tecnica più conosciuta è senz’altro quella in campo chiaro. La microscopia in campo chiaro però ha uno svantaggio: può essere utilizzata solo per i campioni che naturalmente possiedono proprietà tali da influenzare la quantità di luce che passa attraverso di essi e raggiunge infine gli oculari.

Moltissimi campioni biologici e microrganismi mancano tuttavia di queste caratteristiche: la maggior parte dei microrganismi, ad esempio, non ha pigmenti interni e non sono quindi ben visibili al microscopio in campo chiaro, a causa della scarsa differenza di contrasto esistente tra cellule ed ambiente acquoso. Pertanto la loro osservazione richiederà un approccio diverso. Dal momento che i microrganismi si trovano sempre all’interno di una matrice di natura variabile (sangue, campioni di fluidi corporei, terreni di coltura, campioni ambientali, etc..), all’osservazione essi risultano di solito come presenze su di uno sfondo. Se si desidera evidenziarli e metterli in risalto rispetto a quest’ultimo, la cosa più semplice da fare sarebbe sicuramente colorarli, utilizzando delle sostanze chimiche alle quali i microrganismi reagiscono in maniera specifica: non sempre però questo è possibile o raccomandabile. La maggior parte delle tecniche di colorazione infatti uccide i microrganismi, rendendone impossibile l’osservazione in vivo; in certi casi inoltre si possono creare degli artefatti, a causa delle reazioni chimiche tra coloranti e componenti cellulari, che alterano la reale morfologia delle strutture microbiche. Infine esistono microrganismi molto difficili da colorare: in tutti questi casi, la cosa migliore da fare è aumentare il loro contrasto rispetto allo sfondo, modificando piuttosto quest’ultimo.

Siccome è la luce emessa dalla sorgente del microscopio che impatta sul campione e lo rende visibile ai nostri occhi, è proprio sulla luce che si può innanzitutto agire a tal fine. Il cammino dei suoi raggi (dalla sorgente fino ai nostri occhi) ed il modo in cui essi attraversano il vetrino, si può infatti modificare attraverso una serie di filtri ottici che sfasino la luce oppure la condensino in coni: su questo principio si basano la microscopia a campo scuro e quella a contrasto di fase. Queste due tecniche di microscopia ottica hanno il grande vantaggio di permettere sia l’osservazione in vivo che a fresco; inoltre consentono l’osservazione di strutture batteriche altrimenti invisibili perchè di dimensioni inferiori al potere di risoluzione del microscopio, come i flagelli e le fimbrie.

La microscopia a campo scuro

In questa tecnica si utilizza uno speciale condensatore, munito di diaframma, applicato ad un comune microscopio ottico: esso consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano raggiunti soltanto dalla luce diffratta (oppure diffusa) che attraversa il campione (Fig.1)

Schema del microscopio a campo scuro
Figura 1 – Schema del funzionamento del microscopio a campo oscuro

Il microscopio a campo oscuro si ottiene collocando un diaframma apposito (detto:”diaframma per campo oscuro”) sotto al sistema delle lenti del condensatore di un microscopio ottico.
Si viene cosi’ a creare un cono di luce cavo che colpisce l’oggetto: solo la luce riflessa e rifratta proveniente dal campione formerà l’immagine, diversamente da quanto accade nel campo chiaro.
Il condensatore ha lo scopo di dare al preparato un’illuminazione radente, lasciando buia la parte inquadrata dall’obiettivo. In questo modo, soltanto
i raggi che hanno attraversato la struttura biologica verranno raccolti dall’obiettivo, mentre quelli che attraversano il mezzo invece verranno deviati fuori dal campo di osservazione.
Dal momento che il percorso seguito dalla luce della sorgente non è più rettilineo e che parte delle sue componenti sono state inoltre filtrate, l’occhio dell’osservatore percepirà il tipico effetto del campo scuro.

All’osservatore che guarda negli oculari, i microrganismi appariranno come corpuscoli luminosi (di forma ben definita) che risaltano sullo sfondo scuro oppure nero (Fig. 2).

Lattobacilli di yogurt in campo scuro
Figura 2 – Varie specie di lattobacilli in un campione di yogourt

Nella microscopia a campo scuro in particolare, è possibile osservare strutture batteriche quali i flagelli di Treponema pallidum, solitamente di dimensioni ben al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico.

Questa tecnica inoltre risulta molto utile per osservare le diatomee (normalmente invisibili in campo chiaro) ed è sfruttata in diagnostica clinica per un particolare esame del sangue (detto:“esame del sangue vivo”), che consente tra l’altro di verificare facilmente la presenza di parassiti di varie specie.

La microscopia a contrasto di fase

Questa tecnica è quella maggiormente utilizzata quando si vogliono effettuare osservazioni in vivo.

Diversamente dalle precedenti richiede però uno strumento apposito: il microscopio a contrasto di fase, dotato di obiettivi specifici per questo tipo di osservazione e del sistema ottico che ne permette il funzionamento.

La microscopia a contrasto di fase sfrutta le differenze nello spessore e nell’indice di rifrazione delle varie regioni che compongono le cellule.

Quando i raggi di luce provenienti dalla sorgente attraversano il campione, la loro velocità viene influenzata dalle proprietà fisiche dello stesso: la luce viene viene cosi’ rallentata ma a gradi diversi, a seconda dello spessore delle varie componenti cellulari, portando cosi’ ad un cambiamento di fase tra le varie onde di luce (sfasamento).

Questa variazione è un fenomeno ottico normalmente sempre presente ma d’intensità non sufficiente per essere percepito dall’occhio umano.

Il microscopio a contrasto di fase dispone però di un piano di fase, cioè di un materiale otticamente attivo, inserito lungo il percorso dei raggi sopra l’obiettivo.

Esso fa interferire la luce difratta dal campione e quella diretta: in entrambi i casi i raggi luminosi sfasati le compongono andranno cosi’ incontro, prima di raggiungere gli oculari, ad una serie di fenomeni d’interferenza tra loro che li renderanno ora più chiari, ora più scuri (Fig. 3)

Schema del microscopio a contrasto di fase
Figura 3 – Schema del funzionamento di un microscopio a contrasto di fase e del cammino seguito dai raggi di luce.

Questo si tradurrà in quello che la nostra vista percepirà alla fine come diversi toni di grigio: il campione apparirà cioè in diverse gradazioni di bianco e di nero, proprio come stessimo guardando uno di quei vecchi televisori tanto comuni al tempo dei nostri nonni (Fig. 4).

Cymbella aspera in contrasto di fase
Figura 4 – Un bellissimo esemplare di Cymbella aspera, una diatomea, osservata al massimo ingrandimento tramite microscopia in contrasto di fase.

Grazie alla microscopia a contrasto di fase si può inoltre differenziare meglio le strutture interne dei microrganismi a fresco, ben visibili agli alti ingrandimenti, in base alla differente rifrazione presentata dagli organelli rispetto al citoplasma circostante (Fig. 5).

Tecniche di microscopia ottica: Bacillus anthracis in contrasto di fase
Figura 5 – Cellule di Bacillus anthracis osservate al contrasto di fase. Sono ben visibili al loro interno le spore, che risultano rifrangenti alla luce.

La colorazione dei campioni

Le tecniche di microscopia ottica che si basano sulla colorazione dei campioni mirano a migliorare ulteriormente il contrasto dei vari oggetti presenti sul vetrino, agendo però stavolta sui microrganismi in primis anziché sullo sfondo (fanno tuttavia eccezione alcune tecniche in negativo, quali le colorazioni con nigrosina oppure con nero china: per approfondire si rinvia al nostro apposito articolo ).

Quando si utilizzano le colorazioni, l’osservazione viene ovviamente sempre condotta soltanto in campo chiaro.

Esse sfruttano infatti le diverse reazioni tintorie che gli organelli e le componenti cellulari esibiscono quando vengono trattati con certe sostanze e che dipendono dalla loro natura chimica.

Ma di tutto questo, parleremo meglio nella terza parte di quest’articolo.

Fonti

Bibliografia

  • Nicola Carlone, Raffaello Pompei. Microbiologia farmaceutica. Napoli: edizioni Edises, 2013
  • W.M. Becker, L.J. Kleinsmith. Il mondo della cellula.Calenzano (FI): edizioni Pearson, 2013

Sitografia

Crediti per le immagini

Immagine in evidenza:

Figura 1:

https://www.studentidibiologia.it/microbiologia/microscopio-a-campo-scuro/

Figura 2:

Figura 3:

https://www.studentidibiologia.it/microbiologia/microscopio-a-contrasto-di-fase/

Figura 4:

Figura 5:

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