Microscopia ottica: fasi di allestimento di un campione

La funzione principale del microscopio, sia esso ottico che elettronico, è quella di ingrandire particolari che ad occhio nudo risulterebbero invisibili. Sapete com’è possibile che un organismo o un oggetto possano essere osservati al microscopio? Se la risposta è no, per saperlo, basta leggere quest’articolo, in cui descriveremo le fasi fondamentali affinché un campione di nostro interesse possa essere esaminato al microscopio ottico.

Due metodi d’osservazione in microscopia ottica

L’osservazione al microscopio ottico ha come fine l’esame morfologico di cellule e tessuti e può essere di due tipi:

  • Osservazione in vivo;
  • Osservazione di campioni non vitali.

L’osservazione in vivo consente di osservare cellule vive, non trattate e segue gli eventi dinamici degli organismi, come, ad esempio, lo sviluppo embrionale o la mitosi. Si effettua generalmente su cellule isolate o piccoli organismi.

Osservazione in vivo di organismi presenti in una goccia d'acqua di pozza
Figura 1 – Osservazione in vivo di microscopia ottica di organismi presenti in una goccia d’acqua di pozza

Nell’allestire il campione, si utilizzano vetrini portaoggetti su cui si deposita una goccia d’acqua all’interno della quale si pone il campione, ricoperto, al termine, da un vetrino coprioggetto. Molte volte si utilizzano anche particolari vetrini con una conca centrale dove si deposita la goccia d’acqua in cui verrà immerso il campione che, anche in questo caso, verrà ricoperto dal vetrino coprioggetto. Si viene a creare così la “camera umida”, che evita che il campione possa disidratarsi a causa dell’evaporazione del liquido in cui è contenuto.

L’esame a fresco ha un utilizzo limitato in quanto le cellule presentano una scarsa sopravvivenza, un eccessivo spessore e soprattutto un esiguo contrasto. Per ovviare alla totale trasparenza delle strutture cellulari del campione, possiamo utilizzare diverse tecniche fornite dalla fisica e dall’ottica, ad esempio diversi sistemi di illuminazione ed osservazione; in alternativa, si possono utilizzare coloranti vitali, che devono essere ben assorbiti e sopportati dalla cellula. Distinguiamo una colorazione intra vitam e sopravitale.

Tra i coloranti vitali ricordiamo: Alizarina, Blu Tripano, Verde Janus, etc.

Osservazione al microscopio ottico di Hyaloperonospora parasitica in Blu tripano
Figura 2 – Osservazione in microscopia ottica di Hyaloperonospora parasitica in Blu tripano

A causa di queste limitazioni, l’osservazione in vivo, teoricamente favorita, viene utilizzata per una sola osservazione o per rapide osservazioni successive.

Video 1 – Rotifero che cattura un batterio osservato in microscopia ottica

L’osservazione di campioni non vitali invece, consente al meglio lo studio della morfologia interna della cellula, si può effettuare su organismi completi, tessuti, organi, cellule isolate, etc. Questo tipo di osservazione è molto più utilizzata, in quanto i campioni vengono trattati in modo tale da evitare, in seguito all’uccisione, la decomposizione e preservare le loro caratteristiche. Il campione si conserva nel tempo consentendo un maggior numero di osservazioni.

I campioni trattati costituiscono il preparato sitologico.

Preparato istologico di tessuto muscolare cardiaco
Figura 3 – Preparato istologico di tessuto muscolare cardiaco

In definitiva, le fasi fondamentali per allestire un preparato istologico, e che descriveremo nei paragrafi successivi, sono:

  • Prelievo;
  • Fissazione;
  • Inclusione;
  • Sezionamento;
  • Montaggio;
  • Colorazione.

Con le dovute differenze, le fasi elencate valgono anche anche per la microscopia elettronica.

Prelievo

Prima di effettuare il prelievo, un organismo viene sacrificato o anestetizzato.

In seguito, utilizzando lame affilatissime, si procede a prelevare campioni di determinati organi o tessuti da studiare. Questa fase deve avvenire molto rapidamente, in modo da evitare i traumi che sopraggiungono in seguito alla morte cellulare.

Un organismo, molte volte, può essere esaminato in toto, ossia interamente, senza prelevare tessuti o cellule in particolare.

Fissazione

La fissazione è una delle fasi più importanti, in quanto tende a prevenire la decomposizione e mantiene inalterato il quadro strutturale dei tessuti.

In seguito al prelievo, le componenti tissutali che sono state asportate, perdono le loro iniziali proprietà chimiche e fisiche, ciò a causa dei microorganismi che attaccano il materiale biologico e della variazione di temperatura e di pH.

Attraverso la fissazione, si cerca di fissare le molecole di un tessuto allo stato chimico e nella posizione in cui si trovavano in vivo, inoltre, per evitare l’autolisi, si agisce sulle componenti proteiche inattivando degli enzimi.

La fissazione favorisce l’osservazione e la colorazione, consente ai coloranti di penetrare nei tessuti e di fissarsi a particolari strutture.

I fissativi utilizzati si distinguono in fissativi fisici e fissativi chimici.

  • La fissazione fisica può avvenire per rapido riscaldamento, in cui il campione viene essiccato eliminando l’acqua e denaturando la componente proteica, oppure tramite congelamento. Il congelamento prevede due metodi: il metodo del congelamento-essiccamento e congelamento-sostituzione.
  • I fissativi chimici sono suddivisi in: fissativi coagulanti le proteine, come acido acetico o alcool etilico; fissativi non coagulanti le proteine, come la formalina e il tetrossido di osmio.

La formalina (aldeide formica al 40%) è uno dei fissativi maggiormente utilizzato in microscopia ottica.

Formula di struttura della formaldeide
Figura 4 – Formula di struttura della formaldeide

Si possono anche utilizzare miscele fissative costituite da acqua, sali e uno o più fissativi chimici. Tra le miscele ricordiamo il liquido di Bouin, Carnoy, Müller, Susa, etc.

La scelta del fissativo è molto importante e dipende dallo studio da effettuare.

Inclusione

I tessuti biologici prelevati hanno perso la loro consistenza, quindi devono essere inclusi all’interno di materiali più resistenti, in modo tale da acquisire una maggiore rigidità, ideale per il successivo sezionamento. L’inclusione non è necessaria se è avvenuta la fissazione fisica.

Per effettuare l’inclusione possono essere usate diverse sostanze, per la microscopia ottica si utilizza generalmente paraffina.

La paraffina è una miscela di idrocarburi alifatici ed è apolare, ossia non miscibile con l’acqua, quindi prima dell’inclusione è necessaria una disidratazione.

Paraffina in scaglie
Figura 5 – Paraffina in scaglie

Per allontanare l’acqua dai tessuti si utilizzano soluzioni di etanolo sempre più concentrate, in seguito, invece, si utilizza benzene o xilene (causa della diafanizzazione o chiarificazione), sostanze miscibili con la paraffina.

Reso il campione apolare, esso è posto in paraffina fusa, il tutto viene poi colato in stampi metallici e fatto raffreddare a temperatura ambiente.

Si è ottenuto così un blocchetto rigido contenente il campione e pronto per essere sezionato.

Blocchetto di paraffina contenente il campione
Parafa 6 – Blocchetto di paraffina contenente il campione

Sezionamento e montaggio

Il blocchetto di paraffina ottenuto deve essere sezionato ricavando fette estremamente sottili, circa 5-7 µm , in modo tale che la luce possa attraversarle e, dopo la colorazione, siano ben visibili al microscopio.

Prima del sezionamento, con un bisturi o una lametta, il blocchetto deve essere sagomato, si elimina la paraffina in eccesso e si riduce così il suo spessore.

Lo strumento usato in questa fase è il microtomo.

Generalmente, in microscopia ottica, si utilizza il microtomo rotativo, costituito da un braccio, sul quale si monta il blocchetto di paraffina, una lama (generalmente d’acciaio) e una manovella. È proprio il movimento della manovella che avvicina il braccio alla lama di una distanza pari allo spessore delle sezioni desiderato.

Sezionamento al microtomo rotativo
Figura 7 – Sezionamento al microtomo rotativo

Le sezioni ottenute vengono poi montate sul vetrino portaoggetti, sul quale devono essere incise le informazioni riguardanti il campione.

Prima dell’adesione i vetrini devono essere opportunamente sgrassati.

Esistono diverse sostanze adesive da porre sul vetrino per consentire il montaggio delle sezioni, solitamente si utilizza albumina glicerinata. L’albumina glicerinata si prepara a partire da albume d’uovo e glicerina, con aggiunta di sostanze antimuffa.

Al momento dell’utilizzo, alla soluzione di albumina glicerinata, si aggiunge dell’acqua distillata. Si procede ponendo il vetrino su una piastra riscaldata e su di esso, con una pipetta, si pone la soluzione adesiva. Attraverso l’ausilio di un pennello, le sezioni sono poste sulla soluzione adesiva, la quale, essendosi riscaldata, consente la dilatazione della paraffina, di conseguenza la distensione dei tessuti. I vetrini rimangono sulla piastra riscaldata in modo tale da far evaporare la maggior parte della soluzione, in seguito sono posti in stufa per 24 ore a 37 °C per farli essiccare.

Colorazione

La colorazione è la fase propedeutica all’osservazione microscopica, in quanto aumenta il contrasto delle diverse componenti cellulari e tissutali e ne migliora la leggibilità.

I coloranti sono molecole organiche aromatiche e ionizzabili, si usano generalmente in soluzione (importante è la scelta del solvente, generalmente si usano quelli polari) e li classifichiamo in:

  • Sintetici;
  • Naturali;
  • Acidi;
  • Basici.

I coloranti acidi (ricordiamo l’Eosina) si legano a molecole con caratteristiche basiche, come le proteine citoplasmatiche, mentre i coloranti basici (ricordiamo l’Emallume acido di Mayer) si legano a molecole con caratteristiche acide, come il DNA. In genere questi coloranti vengono combinati tra loro per far risaltare al meglio le diverse componenti cellulari e tissutali. Un esempio è la colorazione Ematossilina e Eosina in cui si combina l’azione dell’Emallume acido di Mayer e dell’Eosina.

Sezione della testa e dell'apparato masticatore di un nematode in Emallume & Eosina
Figura 8 – Sezione della testa e dell’apparato masticatore di un nematode in Emallume & Eosina

Esistono, inoltre, tecniche di colorazione diverse: Istologica, Istochimica, Immunoistochimica ed in Immunofluorescenza.

Come già affermato, i coloranti si usano in soluzione e, affinché penetrino nei tessuti, quest’ultimi devono essere idrofili. Dato che il campione è incluso in paraffina, sostanza idrofoba, prima della colorazione, è necessaria una fase di sparaffinatura ed idratazione.

I vetrini sostano per alcuni minuti in xilene, in seguito in etanolo a concentrazione sempre minore ed infine in acqua distillata. Si può procedere così all’esecuzione della colorazione, al termine della quale i vetrini devono essere chiusi e conservati.

La chiusura avviene utilizzando sostanze non miscibili con l’acqua, ma con lo xilene, quali resine sintetiche, ma soprattutto il Balsamo del Canada, resina vegetale. Si eseguiranno i passaggi contrari alla precedente idratazione, i vetrini verranno posti in etanolo a concentrazione sempre maggiore ed infine in xilene. Il Balsamo del Canada si pone sulle sezioni, su di esse, con una pinzetta o con le mani, si lascia cadere il vetrino coprioggetto, sigillando così i campioni, posti in stufa a 40˚C fino a completo indurimento.

Schema riguardante il metodo di chiusura dei vetrini
Figura 9 – Schema riguardante il metodo di chiusura dei vetrini

I vetrini sono adesso pronti per l’osservazione microscopica.

Micrografia

Grazie alle fasi precedentemente descritte, i vetrini, contenenti i campioni di nostro interesse, possono essere finalmente osservati al microscopio ottico.

Fin dall’antichità si è sempre avuta la necessità di conservare o registrare ciò che veniva osservato.

Inizialmente ci si limitava all’osservazione diretta e alla sua descrizione verbale, in seguito, i morfologi, adottarono il disegno come strumento principale per la diffusione delle osservazioni.

Robert Hooke, fisico, biologo, geologo, architetto e sperimentatore, nel 1665 pubblicò Micrographia.

Micrographia è un’opera, o meglio capolavoro, contenente illustrazioni dettagliate di esemplari osservati ai microscopi progettati da Hooke.

Frontespizio ed alcune illustrazioni contenute in Micrographia
Figura 10 – Frontespizio ed alcune illustrazioni contenute in Micrographia
Video 2 – Visione di alcune pagine di Micrographia

È solo grazie all’avvento della fotografia che la documentazione e la condivisione di osservazioni e scoperte divenne più semplice, soprattutto con l’introduzione di immagini digitali, le quali sono generate per via elettronica e presentano un’alta definizione. Possiamo così parlare di micrografia: fotocamera collegata ad un microscopio che consente la cattura di immagini riguardanti i campioni osservati.

In definitiva, tutti i risultati sperimentali che si ottengono con l’osservazione al microscopio ottico, durante un’indagine scientifica, acquisiscono maggiore rilevanza grazie alla loro facile condivisione.

Fonti

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