Preparazione dei campioni per la microscopia elettronica

L’osservazione al microscopio di oggetti, organismi, etc.., viene effettuata quando sono richiesti ingrandimenti notevoli di un campione. Le tecniche utilizzabili sono varie ma è fondamentale, per ognuna di esse, la preparazione del campione da esaminare, che varia a seconda del metodo utilizzato. Ad esempio, l’osservazione al microscopio (sia ottico che elettronico) dei campioni biologici richiede che i preparati siano sufficientemente sottili da risultare trasparenti rispettivamente al fascio di luce o di elettroni e, inoltre, che sia preservata l’integrità delle cellule e degli organelli che si vuole analizzare.

Tecnica delle fette

In linea di principio, l’allestimento dei preparati biologici in microscopia elettronica segue gli stessi criteri della microscopia ottica, sopratutto per quanto riguarda la “tecnica delle fette“. Tuttavia sono necessarie alcune modifiche:

  • Prelievo: le dimensioni del campione sono dell’ordine di 1-2 mm3. Il prelievo va effettuato a freddo in specifici tamponi;
  • Fissazione: è eseguita a freddo con fissativi chimici non coagulanti (es. paraformaldeide, gluteraldeide) a cui segue la post-fissazione in tretossido di osmio;
  • Inclusione: il campione viene incluso in plastica (resine epossidiche);
  • Sezioni: si usa l’ultramicrotomo con cui si possono ottenere sezioni ultrafini (80-100 nm);
  • Colorazione: si usano sali di metalli pesanti opachi agli elettroni, ad esempio piombo, uranio o oro;
schema della tecnica delle fette in microscopia elettronica
Figura 1 – Schema della tecnica delle fette in microscopia elettronica
PassaggioMicroscopia otticaMicroscopia elettronica
Fissazioneformalina + ac. picricoglutaraldeide, ac. osmico
Inclusioneparaffinaresine epossidiche
Sezionamentomicrotomoultramicrotomo
Spessore fette7-10 µm80-100 nm
Supportovetrinoretino di rame
Colorazionecoloranti organicimetalli pesanti
Figura 2 – Confronto della tecnica delle fette in microscopia ottica ed elettronica

Possibili problematiche nella preparazione dei campioni

Quando facciamo riferimento alla microscopia elettronica, è importante ricordare sempre che si analizzano sezioni dello spessore di 50-80 nm. Se in microscopia ottica basta creare un campione a due facce piane, per la preparazione dei campioni per il microscopio elettronico è necessario intervenire in vario modo, tenendo conto della tipologia di microscopio (TEM o SEM) e delle caratteristiche proprie del campione che si sta per analizzare. Ad esempio, con il SEM, il problema più grande che va affrontato è il caricamento di un campione non conduttore: in tal caso gli elettroni tendono a rimanere fermi dove arrivano e si crea così una nuvola negativa. Gli elettroni che arrivano successivamente cambieranno traiettoria causando un’immagine in uscita deformata che diventa sempre più chiara. Per consentire all’operatore di ottenere informazioni di alta qualità è necessario metallizzare il campione con un sottile strato (~10 nm) di un materiale conduttivo come oro, argento, platino o cromo. Come è facilmente comprensibile, ci sono alcuni inconvenienti quando si utilizza il metallizzatore perché potrebbe portare ad un’alterazione della topografia della superficie o falsare le informazioni elementari relative al campione.

Tecniche specifiche in uso in microscopia elettronica

Le tecniche di microscopia elettronica possono essere considerate “problematiche” per vari motivi:

  • Il fascio di elettroni generato può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto;
  • La maggior parte dei tessuti biologici sono molli e, di conseguenza, prima del taglio devono essere induriti per fissazione, inclusione o congelamento;
  • I tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto.

Nonostante ciò, sono state sviluppate diverse metodiche in grado di agevolare l’osservazione microscopica (qui di seguito verranno elencate tre delle principali tecniche).

Montaggio e colorazione

Se i campioni sono sottili e piccoli possono essere montati direttamente su un film sottile di supporto e introdotti nel microscopio elettronico. Il contrasto è dato dall’introduzione di atomi di metalli pesanti in uno dei seguenti modi:

  • Colorazione positiva: il campione viene colorato chimicamente con una soluzione di sali pesanti e appare scuro su sfondo chiaro;
  • Colorazione negativa: il campione rimane incolore ma è bloccato in un film di sale del metallo pesante che è stato opportunamente essiccato. Il campione appare chiaro su sfondo scuro (applicata soprattutto per lo studio di virus e macromolecole).
batteriofago evidenziato tramite colorazione negativa
Figura 3 – Batteriofago evidenziato tramite colorazione negativa

Tecnica dell’ombreggiatura

Per ottenere effetti tridimensionali è necessario utilizzare la tecnica dell’ombreggiatura. Si procede ricoprendo il preparato con un sottile strato di metallo vaporizzato, come il platino, che viene spruzzato da un angolo obliquo e si deposita in ragione della conformazione irregolare della superficie. Lo spessore del metallo, perciò, è più o meno sottile nelle diverse zone e il risultato finale è un’immagine con aree più scure che appaiono come ombre e aiutano a percepire lo spessore dei diversi oggetti.

tecnica dell'ombreggiatura
Figura 4 – A sinistra si osserva l’immagine normalmente ottenuta al microscopio elettronico e a destra è possibile apprezzare il miglioramento della stessa data dalla tecnica dell’ombreggiatura

Però, la vera tridimensionalità si ottiene solo con l’utilizzo del microscopio elettronico a scansione. In questo caso il preparato viene ricoperto con un velo di metallo, poi un sottile fascio di elettroni scansiona tutta la superficie così che un rilevatore misuri l’intensità degli elettroni secondari emessi dal campione a seguito della sollecitazione. Il potere risolutivo è minore rispetto a quello del microscopio elettronico a trasmissione ma le immagini ottenute elaborando il segnale con un computer (con la possibile aggiunta di falsi colori) presentano luci e ombre che danno un’idea molto verosimile delle superfici cellulari.

Freeze etching

Il criodecapaggio, o freeze etching, è una delle tecniche che può essere usata per analizzare la struttura macromolecolare delle membrane biologiche. Questa tecnica di laboratorio si basa sulla possibilità di ottenere repliche fedeli delle superfici di materiali biologici (cellule o tessuti), dopo averli congelati sottovuoto a bassissime temperature (immersione in azoto o elio liquido), e offre l’opportunità di evitare metodi più invasivi quali l’uso di fissativi chimici, disidratanti o materiali per inclusione. Quando l’oggetto congelato è colpito da una lama, anch’essa congelata, avviene una frattura su piani preferenziali, di solito dovuti a regioni di legami particolari.

Ad esempio, si possono evidenziare le proteine transmembrana poiché il piano di frattura passa normalmente attraverso il doppio strato lipidico che costituisce la membrana cellulare.

schema della tecnica del freeze etching
Figura 5 – Schema della tecnica del freeze etching

La tecnica del criodecapaggio non è immune dalla possibilità di artefatti, in quanto si possono ottenere distorsioni delle strutture come conseguenza della formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento.

Il campione analizzato con il microscopio SEM o TEM

Abbiamo visto che il campione analizzato con il microscopio elettronico può essere preparato in differenti modi. Nel caso della microscopia SEM, i campioni possono avere qualsiasi forma perché ne viene analizzata solo la superficie. In particolare, avviene una scansione spostando il fascio elettronico incidente lungo l’intera superficie del campione. Tuttavia, la risoluzione massima ottenibile da un microscopio elettronico (circa 0.2 nm) è garantita dal TEM: in questo caso la preparazione del campione da analizzare è un punto particolarmente delicato.

Il metodo più comune per preparare campioni per la microscopia elettronica a trasmissione richiede il taglio dei tessuti in sezioni ultrasottili che devono essere chimicamente fissati e stabiliti (sebbene la fissazione uccida le cellule, mantiene le componenti cellulari così com’erano nelle cellule viventi). Invece la forma e la superficie di oggetti molto piccoli, come virus e organelli, possono essere esaminate senza applicare un taglio ma facendo uso della tecnica della colorazione positiva o negativa: i campioni intatti sono semplicemente visualizzati in rilievo contro uno sfondo, rispettivamente, chiaro o scuro.

Quando si prepara un campione per la microscopia elettronica a scansione, Io scopo è preservare le componenti strutturali della superficie cellulare e trattare il tessuto in modo che sia minimizzato il danno provocato dal flusso elettronico. La preparazione del campione prevede la fissazione ma non il sezionamento (tipico in TEM): quest’ultimo va asciugato in condizioni di temperatura e pressione controllata (impiego dell’essiccatore al punto critico) e, quindi, montato e ricoperto (sputter coating), è pronto per essere analizzato al SEM.

Quest’ultima analisi, difatti, ci permette di capire che le due tecniche forniscono informazioni diverse ma complementari a causa della necessità di avere una diversa preparazione del campione.

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