Antibiogramma

Principio

L’antibiogramma (ABG) è un test di laboratorio che permette di identificare l’antibiotico più efficace per combattere uno specifico microrganismo. Si tratta di un esame molto utile per determinare la terapia più adatta in presenza di determinati processi infettivi a partire da materiale biologico prelevato dal paziente, perché permette la scelta dell’antibiotico più adatto al caso in analisi.

Inoltre, identificare il giusto antibiotico per uno specifico microrganismo permette di limitare il crescente problema della multiresistenza. In caso di sospetta infezione, si prelevano dei campioni colturali indirizzati ad un laboratorio biologico dove saranno successivamente analizzati per evidenziare la presenza o meno di un agente patogeno.

I campioni raccolti possono essere di varie tipologie:

  • sangue per le emocolture;
  • urine per l’urinocoltura;
  • broncoaspirato;
  • tamponi effettuati sulle ferite;
  • liquido pleurico o peritoneale.

Le indicazioni per il prelievo possono essere diverse, ma in linea generale è indicata una coltura in presenza di segni e sintomi che possano far sospettare un’infezione, come febbre, indici di flogosi in aumento, emodinamica instabile o sintomi come bruciore alla minzione o fuoriuscita di materiale purulento da una ferita.

Il materiale raccolto viene inviato al laboratorio di microbiologia di competenza, dove verrà predisposto un terreno di coltura per valutare l’eventuale presenza di microrganismi. Se nel terreno di coltura c’è un’effettiva crescita di uno o più microrganismi, il campione viene messo a contatto con dischetti imbevuti di antibiotico.

A seconda del comportamento del microrganismo a contatto con il principio attivo del farmaco, si indentifica l’antibiotico più efficace per quel batterio. L’obiettivo dell’antibiogramma è valutare la resistenza o la sensibilità del microrganismo ai vari antibiotici. Quando un microrganismo è sensibile ad un antibiotico significa che la somministrazione di quella molecola è in grado di debellarlo. Se invece è resistente, l’antibiotico in questione sarà inefficace nei confronti di quel batterio.

Metodo

Le tecniche applicate per valutare la sensibilità o la resistenza di un batterio ad un determinato antibiotico sono:

  • Tecnica per diffusione mediante l’utilizzo di dischetti: ha lo scopo di individuare la classe di antibiotici o l’antibiotico specifico a cui risulta sensibile il microrganismo di interesse;
  • Tecnica per diluzione: permette di valutare la minima concentrazione di uno specifico antibiotico in grado di inibire la crescita batterica.

Metodo per diffusione-test di Kirby-Bauer

Le tecniche di diffusione del disco sono utilizzate dalla maggior parte dei laboratori per testare regolarmente la suscettibilità antimicrobica. Un disco di carta assorbente viene impregnato con un volume noto e una concentrazione appropriata di antimicrobico e viene posto su una piastra di agar per testare la sensibilità dell’organismo in esame inoculato nel terreno.

L’antimicrobico si diffonde dal disco nel terreno e la crescita dell’organismo in esame è inibita a una distanza dal disco che risulta proporzionale alla suscettibilità dell’organismo. La validità di questa tecnica attentamente standardizzata dipende dall’utilizzo di dischi con un contenuto antimicrobico corretto, un inoculo che dia una crescita confluente e un agar Mueller Hinton ottimale. Dopo l’incubazione a 35 °C per 16–18h, le dimensioni delle zone di inibizione della crescita vengono misurate e interpretate utilizzando gli standard NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Questi ultimi sono derivati ​​dalla correlazione che esiste tra le dimensioni delle zone di inibizione e le MIC.

I ceppi sensibili all’antimicrobico sono inibiti a una distanza dal disco cospicua mentre i ceppi resistenti hanno zone di inibizione più piccole o crescono fino al bordo del disco. Se si crea un alone bianco e trasparente attorno al punto in cui viene seminato l’antibiotico, allora il microrganismo responsabile dell’infezione è sensibile al farmaco. Se invece, le colonie del microrganismo continuano ad estendersi, si riscontra una resistenza all’antibiotico utilizzato.  

Il diametro dell’alone in millimetri è correlato alla sensibilità del batterio all’antibiotico. Maggiore è l’alone e maggiore sarà la sensibilità del batterio all’antibiotico. Minore è l’alone e maggiore sarà la resistenza del batterio all’antibiotico.

Metodo per diffusione o Test Kirby-Bauer. I dischetti imbevuti con diversi antibiotici sono posizionati su una piastra in cui è presente il patogeno in questione. In base al diametro dell'alone di inibizione viene valutata la sensibilità del batterio al farmaco.
Figura 2: Metodo per diffusione o Test di Kirby- Bauer. I dischetti imbevuti con diversi antibiotici sono posizionati su una piastra in cui è presente il patogeno in questione. [Fonte: Alessia Caruso]

Metodo per diluizione

Una volta individuato l’antibiotico che rende sensibile il batterio, è necessario valutare la concentrazione in grado di limitarne la crescita. Il metodo per diluizione valuta la resistenza batterica ad un singolo antibiotico in concentrazioni crescenti e permette di calcolare la minima concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica e la minima concentrazione battericida.

Prima di tutto occorre allestire una serie di provette contenenti un terreno di arricchimento liquido. Il passaggio successivo consiste nell’ottenere una diluizione seriale dell’antibiotico preso in esame. A questo punto si ottengono una serie di provette aventi concentrazioni decrescenti di antibiotico.

In seguito l’inoculo batterico preso in considerazione viene seminato in ogni provetta a concentrazione costante. Le provette vengono incubate a 37 °C per 24h.

Per riscontrare la crescita batterica occorre valutare la torbidità delle singole provette, corrispondente ad un indice importante che attesta lo sviluppo di colonie batteriche. Le provette con una minore concentrazione di antibiotico presenteranno una maggiore torbidità, indice di una cospicua crescita batterica. Si riscontrerà una progressiva diminuzione della torbidità del terreno man mano che la concentrazione dell’antibiotico aumenta. La prima provetta individuata contenente un terreno limpido, corrisponde alla minima concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica (MIC).

MIC e MBC

Una volta misurata la MIC è possibile anche determinare la concentrazione minima battericida (MBC) che corrisponde alla concentrazione più bassa dell’antibiotico in esame necessaria per provocare la morte di più del 99.9% di un dato microrganismo. In questo caso è necessario piastrare ed incubare il materiale di ogni provetta in singoli terreni di coltura. In ogni terreno è necessario riportare la concentrazione dell’antibiotico preso in esame. Dopo 24h si valuta la crescita batterica.

La crescita nel terreno di coltura diminuirà all’aumentare della concentrazione dell’antibiotico presente nelle provette. Il primo terreno in cui non viene riscontrata crescita batterica corrisponde alla provetta contenente una quantità di antibiotico sufficiente per uccidere tutti i batteri presenti al suo interno. La MBC può essere uguale o maggiore della MIC.

Test per diluizione utilizzato per valutare la MIC e la MBC.
Figura 3: Test per diluizione utilizzato per valutare la MIC (minima concentrazione inibente) e la MBC (minima concentrazione battericida). [Fonte: Alessia Caruso]

Risultati attesi

  • Interpretazione dei risultati del Metodo per diffusione:

I risultati possono essere letti dopo 18h di incubazione. Dopo l’incubazione, è necessario misurare le dimensioni delle zone di inibizione utilizzando un righello o un calibro includendo il diametro del disco nella misurazione. Utilizzando le linee guida CLSI (Clinical and Laboratory Standards Insitute), è possibile determinare la suscettibilità o la resistenza dell’organismo a ciascun farmaco testato. Per ogni antibiotico infine bisogna indicare e registrare se la dimensione della zona di inibizione indentifica il microrganismo suscettibile (S), intermedio (I) o resistente (R) in base alla tabella di interpretazione. 

  • Interpretazione dei risultati del metodo per diluizione:

La minima concentrazione inibente la crescita del batterio in esame corrisponde alla provetta in cui è presente la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire lo sviluppo e la crescita microbica.

Nel referto dell’antibiogramma viene sempre indicato:

  • la tipologia di campione prelevato;
  • il microrganismo/i isolato/i;
  • la carica batterica di ognuno, indicata in CFU/ml (unità che formano la colonia/ml);
  • i vari antibiotici associati al valore della MIC (minima concentrazione inibente)
  • sensibilità, sensibilità intermedia o resistenza del microrganismo all’antimicrobico.
Antibiogramma
Figura 3: Antibiogramma [Fonte: www.wikipedia.org]

Limitazioni del Test

I test di sensibilità misurano l’attività antimicrobica contro i batteri in condizioni di laboratorio (in vitro), non nel paziente (in vivo). Quindi non si può presumere che un antimicrobico che uccide o previene la crescita in vitro di un organismo possa essere un trattamento altrettanto efficace in vivo.

La tecnica Kirby-Bauer deve essere utilizzata:

  • solo per specie batteriche ben valutate; 
  • non è adatta per batteri a crescita lenta, che necessitano di nutrienti speciali o che richiedono CO2 o incubazione anaerobica;
  • deve essere necessariamente associata alla metodica per diluizione per identificare la minima concentrazione inibente (MIC).

La selezione di un trattamento antimicrobico appropriato implica anche la considerazione delle condizioni cliniche del paziente. Qualsiasi condizione sottostante come la presenza di eventuali patologie, il tipo e la sede dell’infezione, qualsiasi storia di ipersensibilità al farmaco, età e presenza di un’eventuale gravidanza deve essere ben chiara.

È inoltre necessario conoscere l’attività dei diversi farmaci inclusi i loro tassi di assorbimento, diffusione nei tessuti, metabolismo, escrezione e anche la possibile tossicità e gli effetti sulla normale flora microbica del paziente. Infine è opportuno tenere in considerazione anche il costo e la disponibilità di un farmaco.

Quality control

Il test di sensibilità agli antibiotici è molto utile per orientare in maniera ottimale la terapia antibiotica e per monitorare l’evoluzione della resistenza batterica. La NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) detta delle regole generali a livello internazionale per l’applicazione dei test di sensibilità agli antibiotici e le classi di antibiotici da testare.

Tale analisi standardizzata prende in considerazione alcuni fattori:

  • la purezza del ceppo da testare;
  • la densità dell’inoculo;
  • le condizioni di incubazione;
  • il metodo di lettura del risultato;
  • i criteri biologici e clinici per l’interpretazione del risultato.

Fonti

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