Candida spp. e micosi invasive
L’Identificazione di Candida spp. è necessaria in particolar modo quando si sospetta una micosi profonda o sistemica. Le micosi invasive sono infezioni fungine in cui sono coinvolti uno o più organi interni. Possono essere causate da patogeni obbligati (i miceti dimorfi) oppure da miceti opportunisti (lieviti e miceti filamentosi ialini o dematiacei). Nel primo caso possono interessare anche soggetti sani, mentre nel secondo caso colpiscono per lo più pazienti immunocompromessi o comunque che presentano fattori di rischio anche per altre patologie sottostanti. La modalità di infezione è quasi sempre inalatoria: ad una prima infezione polmonare, molte volte asintomatica, può seguire la disseminazione per via ematogena, con diffusione ad altri organi interni. L’esito è spesso infausto, anche a causa delle difficoltà diagnostiche e delle limitate opzioni terapeutiche a disposizione del medico curante, nonostante la recente disponibilità di nuovi farmaci antifungini.
In particolare in pazienti oncologici con drenaggi percutanei sono stati descritti ascessi epatici, subfrenici e localizzati alla colecisti, mentre la peritonite da Candida spp. è stata osservata in pazienti sottoposti per periodi prolungati a dialisi peritoneale ambulatoriale. La candidosi disseminata (acuta o cronica) è associata ad un alto tasso di mortalità. La candidemia è ai primi posti tra le cause di infezioni ospedaliere del torrente circolatorio sia negli Stati Uniti che nel resto dei Paesi industrializzati. E’ responsabile di più della metà degli episodi di sepsi nei pazienti non neutropenici ricoverati in reparti di Terapia Intensiva o in Chirurgia.
Diagnosi precoce di Candida
La risoluzione della candidosi è collegata ad una diagnosi precoce per l’adozione di una adeguata terapia antifungina, in particolar modo nei pazienti critici.
La diagnostica delle micosi risulta complessa sia per la mancanza di sintomatologia ascrivibile a tale patologia, sia perché i metodi tradizionali basati sulla crescita in piastra sono poco specifici e lenti (2-3 giorni). Esiste, a tal proposito, la possibilità di falsi positivi e falsi negativi nella Identificazione di Candida spp. I metodi fenotipici basati sull’identificazione di prodotti cellulari sono delicati, perché anche minime variazioni delle condizioni di crescita, portano a diverse espressioni geniche negli isolati che subiscono switching isotipico. Le tecniche sierologiche sono rapide ma poco sensibili dunque le tecniche molecolari offrono un’alternativa rapida e precisa di identificazione di specie.
Tali metodiche risultano indispensabili durante le indagini epidemiologiche per individuare le origini di outbreak epidemici. Sono necessarie anche per intercettare, all’interno degli stessi isolati, eventuali modificazioni post terapia antimicotica. Alcune tecniche di amplificazione vengo impiegate direttamente per individuare il lievito nei campioni clinici, ove la loro quantità è minima. Altre hanno come obiettivo il confronto tra ceppi o cloni della speci e si effettuano su colonia. A volte è preferibile usare due tecniche di genotipizzazione contemporaneamente.
Abbiamo molte tecniche di Identificazione di Candida spp. a nostra disposizione
- Per la PCR i target sono sequenze specie-specifiche o genere specifiche con successiva analisi dei prodotti. I geni dell’rRNA 18S, 5,8S e 28S sono presenti in più copie e sono specie-specifici, separati da spaziatori (ITS1 e ITS2) con aree variabili utili per tracciare i primers specifici.
- Nella nested PCR si ha il vantaggio di utilizzare primers con sequenze universali per ottenere ampliconi di un ampio spettro di specie, per poi utilizzare coppie di primers altamente specifici ma lo svantaggio sta nella cross contaminazione.
- Possiamo usare una AP-PCR. Una arbitrary primer PCR con primers molto piccoli di 10 basi e a bassa stringenza (35-40 °C MgCl2). Ci permette di studiare questi ampliconi con l’analisi di lunghezza su gel di con elettroforesi automatizzata su sistemi capillari.
- In alternativa si possono usare analisi con enzimi di restrizione in base al polimorfismo conformazionale a singolo filamento (RFLP).
- L’analisi dei prodotti può essere bypassata usando nuove tecnologie. Tra queste la qRT-PCR che amplifica e quantifica direttamente e in tempo reale, grazie all’utilizzo di sonde marcate con sostante fluorescenti. In aggiunta tramite la multiplex PCR si possono identificare anche più specie contemporaneamente.
- Degna di nota è anche la tecnica NASBA che, per l’amplificazione dell’rRNA 18S, prevede l’uso di tre enzimi (trascrittasi inversa, RNasi H e T7RNA) che vengono addizionati in fasi precise e ne aumentano la performance, ma sono ancora abbastanza costosi.
- Tra i metodi che non contemplano l’amplificazione esiste anche la FISH o Ibridazione Fluorescente in Situ che permette di identificare direttamente sul campione fissato su vetrino e che meriterebbe un articolo a parte come anche la PFGE.
La tecnica che ad oggi è sicuramente la più promettente in questo campo: MLST
La MLST o Multi-locus Sequence Typing consiste nell’utilizzo di frammenti delle sequenze di alcuni geni costitutivi (Housekeeping), ognuna della lunghezza di 400-500pb, che vengono sequenziati per rilevare polimorfismi del fenotipo quando confrontati con quelli di un database per la caratterizzazione del lievito quindi l’Identificazione di Candida spp.
Considerazioni conclusive
I saggi molecolari svolgono un ruolo importante nello sviluppo di metodi non colturali volti a migliorare la diagnosi di malattie infettive. Per la diagnostica fungina, nonostante decenni di esperienze, i saggi molecolari non sono ancora considerati tra i criteri di riferimento per definire una malattia fungina, principalmente per la mancanza di una diffusa standardizzazione e di dati adeguati di outcome clinico. Lo sviluppo e l’utilizzo di test commerciali non potrà che contribuire ai processi di standardizzazione e validazione clinica. Sono certamente necessari ulteriori dati e approfondimenti sia sulle ricadute da un punto di vista clinico che sul rapporto costo efficacia per comprendere a pieno la loro reale valenza diagnostica.
