Test dell’utilizzo del citrato

Citrate utilization test

Principio

Il test di utilizzo del citrato è comunemente impiegato nell’ambito di un gruppo di test che distinguono i membri della famiglia delle Enterobatteriacee in base ai loro sottoprodotti metabolici. Il test di utilizzo del citrato viene impiegato, assieme ad altri test metabolici, per determinare la capacità dei batteri di utilizzare il citrato di sodio come unica fonte di carbonio e il fosfato di monoammonio (NH4H2PO4) come unica fonte di azoto. Alcuni kit di test come l’API-20E e l’Enterotube II includono il mezzo di utilizzo del citrato come uno dei test diagnostici.

In questo test viene solitamente usato il terreno di Simmons, la cui composizione è la seguente:

Figura 1 – componenti del terreno di Simmons

Dall’utilizzo di un acido organico come il citrato come fonte di carbonio ed energia, i prodotti finali risultano essere carbonati alcalini e bicarbonati. Inoltre, l’idrossido di ammonio risulta come prodotto quando i sali di ammonio nel mezzo vengono utilizzati come unica fonte di azoto. L’utilizzo del citrato esogeno richiede la presenza di proteine di trasporto del citrato. Al momento dell’assorbimento da parte della cellula, l’enzima citrato liasi scinde il citrato in ossaloacetato e acetato. L’ossaloacetato viene quindi metabolizzato in piruvato e CO2.

Citrato = acetato + Ossalacetato ; Ossalacetato = piruvato + CO2

L’anidride carbonica rilasciata reagirà successivamente con l’acqua e lo ione sodio nel mezzo per produrre carbonato di sodio, un composto alcalino che aumenterà il pH. Inoltre, l’idrossido di ammonio viene prodotto quando i sali di ammonio nel mezzo vengono utilizzati come unica fonte di azoto. La crescita di solito determina una modifica colorimetrica dal verde al blu. L’indicatore di pH blu di bromotimolo è di un verde intenso a pH neutro. Con un aumento del pH medio superiore a 7,6, il blu di bromotimolo diventa blu.

Figura 2 – crescita microbica positiva di colore blu paragonata ad assenza di crescita, di colore verde

Figura 3 – altra immagine che rappresenta il test dell’utilizzo del citrato positivo di colore blu e negativo di colore verde, sia nelle provette che in piastra

I microrganismi che saranno positivi al test dell’utilizzo del citrato sono:

  1. Klebsiella pneumoniae
  2. Enterobacter spp.
  3. Citrobacter freundii
  4. Salmonella spp.
  5. Serratia marcescens
  6. Proteus mirabilis
  7. Providencia spp.

I microrganismi che non saranno positivi al test dell’utilizzo del citrato sono:

  1. Escherichia coli
  2. Shigella spp.
  3. Salmonella typhi
  4. Salmonella paratyphi A
  5. Morganella morganii
  6. Yersinia enterocolitica

Altri microrganismi daranno dei risultati variabili in base ai ceppi di riferimento:

  1. Proteus vulgaris
  2. Vibrio cholerae
  3. Vibrio parahaemolyticus

Metodo

  • Inoculare nel terreno di Simmons una colonia incubata tra le 18 e le 24 ore;
  • Incubare tra 35 °C e 37 °C per 18-24 ore;
  • Osservare lo sviluppo di colore blu che ne indicherà la crescita.

Risultati attesi

  • Crescita: la crescita sarà visibile nel mezzo, che sarà di un intenso colore blu. Questo in quanto i carbonati alcalini e i bicarbonati prodotti come sottoprodotti del catabolismo del citrato aumentano il pH del mezzo a oltre 7,6, facendo cambiare il blu di bromotimolo dal colore verde originale al blu.
  • Assenza di crescita: Non si verificherà alcun cambiamento di colore ed il mezzo rimarrà di colore verde. Solo i batteri che possono utilizzare il citrato come unica fonte di carbonio ed energia saranno infatti in grado di crescere sul terreno di Simmons, quindi una coltura citrato-negativa sarà praticamente indistinguibile da una terreno senza inoculo.

Limitazioni del test

  • Alcuni microrganismi sono in grado di crescere sul citrato e non producono un cambiamento di colore;
  • Alcuni test possono dare dei risultati equivoci e dovrebbero essere ripetuti;
  • Diversi microrganismi possono richiedere fino a 7 giorni di incubazione a causa del loro tasso di crescita limitato sul terreno;
  • Le reazioni di questo mezzo da solo non sono sufficienti per l’identificazione a livello di specie.

Quality control

  • Positive: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 (crescita; colore blu)
  • Negative: Escherichia coli ATCC 25922 (non crescita; colore verde)

Fonti

Informazioni su Francesco Centorrino 69 Articoli
Laureato in biologia ed appassionato di tecnologia, cinema, scienza e fantascienza.

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