Megaterium: il Bacillus divoratore di olio diesel marino

L’ambiente marino, che ha fatto da culla ancestrale ad ogni forma di vita, paga, da sempre, i costi della nostra incuria e delle nostre incapacità. Si guarda ad questo come ad una magnifica soluzione tampone, in grado di neutralizzare puntuale ogni forma di turbativa chimico-fisica. Per esempio, le rovinose perdite di carburanti nautici. Sotto forma di olio diesel, esse avvelenano cronicamente flora e fauna marine. Tuttavia, non mancano microbi problem solver, in grado di frapporsi tra lo scempio ed il disastro. Questa è la volta del Bacillus megaterium.

Petrolio fuori posto

Durante le fasi di estrazione e processamento si producono grandi quantità di inquinanti e residui, costituiti da idrocarburi, mentre perdite di greggio si verificano, troppo spesso, nelle pratiche di trasporto. Nonostante le statistiche, aggiornate annualmente su simili nefaste evenienze, registrino, tra il 1970 ed il 2015, una riduzione del numero e della portata degli episodi, ancora 1.3 milioni di tonnellate di petrolio sono disperse in mare. In barba alle costanti implementazioni legislative.

Una volta disperso in acqua, il petrolio forma chiazze superficiali (Figura 1), ben più che antiestetiche. Deturpano, sì, la gamma cromatica di un capolavoro naturale, ma, quel che è peggio, occludono la zona di maggior scambio vitale gassoso con l’atmosfera. Soffocano letteralmente l’immenso corpo idrico. Il rapporto O₂/CO₂ mostra, infatti, deplezione d’ossigeno ed sancisce un disequilibrio biochimico, dalle proporzioni umanamente inconcepibili.

Il Bacillus megaterium salverà il mare dagli idrocarburi del petrolio? — *Figura 1 – Chiazza da idrocarburi sulla superficie marina [Fonte: pixabay.com]*

La fotosintesi, infatti, unica strategia di sopravvivenza per la flora, anche oceanica, risulta impraticabile nell’interfaccia superficiale degli oceani: il film idrocarburico, d’altronde, filtra mortalmente gli ultravioletti solari. E, naturalmente, le perdite di idrocarburi penetrano impietosamente anche le catene trofiche, che nei mari pullulano, e, anello dopo anello, raggiungono le nostre cucine, i nostri piatti, i nostri organi.

Rhizobacteria nel suolo, Bacillus megaterium in mare: la Bioremediation si evolve sempre

Quantità e qualità della miscela oleosa, che opprime gli ecosistemi acquatici, determinano la durata dell’inquinamento, almeno secondo JL Xue e colleghi. Come nel suolo la rhizoremediation prende piede, rispetto a metodi fisici, chimici e termici, nei corpi idrici la bioremediation batterica appare l’unica via percorribile. Quel che si cerca di evitare sono sempre costi elevati e sconvenienti, paradossali, contraccolpi ambientali.

In Cina, molti microrganismi indigeni hanno la capacità di degradare il petrolio: 79 generi batterici, 9 generi cianobatterici, 103 generi fungini e 19 generi algali. Tuttavia, essendo, come detto, il petrolio una miscela di differenti strutture idrocarburiche, gli effetti concreti, sulla degradazione di queste, differiscono. Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Acinetobacter, Enterobacter sono i biodegradatori principali. Tutti, sono in grado di metabolizzare idrocarburi alifatici, cicloesano, alchilbenzene, dicicloalcano. Michaud e colleghi hanno già, da anni, isolato Arthrobacter e Rhodococcus come degradatori di diesel in mare. Ma, per il momento, purtroppo, l’incessante stillicidio oleoso in mare rende pressochè vana la loro efficienza metabolico-degradativa. Finora, la remediation non è in grado di emendare tutti i nostri errori, e salvarci dal tracollo logico ed ecologico.

Quindi la scoperta: il Bacillus megaterium

I ricercatori guidati da Jin Gao si sono dunque impegnati nella ricerca di batteri in grado di degradare il diesel disperso in mare, in modo stabile ed efficiente. L’olio diesel, combustibile liquido per motori meno veloci, come quelli nautici, e caratterizzato da un punto finale di fusione di 360 °C, è responsabile del fenomeno delle piogge acide, come pure della nitrificazione e dell’eutrofizzazione. Proprio a proposito di questa forma di iperproliferazione algale (l’eutrofizzazione), si riscontra già in studi precedenti quanto la biodisponibilità di azoto supporti, in realtà, la biodegradazione di petrolio marino. Un nominale controsenso che merita una riflessione più approfondita, tra pro e contro.

Cronache di laboratorio

Le fasi sperimentali hanno avuto inizio con il campionamento dell’acqua marina (5 mL) presso Jiaozhou Bay, in Cina. I campioni posti in beute contenenti 100 mL di medium minerale (K₂HPO₄ 1 g, NH₄NO₃ 1 g, acqua marina sterilizzata 1 L, pH 7.0 -7.5), con olio diesel (400 mg/L). Incubati a 28°C e 130 r/min per 5 giorni, tale processo di arricchimento dei campioni si è ripetuto, fino a raggiungere la concentrazione inquinante di 600 mg/L. Dopo due trasferimenti, i ricercatori hanno inoculato diluizioni seriali, delle colture arricchite, in un mezzo solido: LB agar. Quindi, incubazione nelle stesse condizioni sperimentali, che dopo 3 giorni ha prodotto colonie con morfologie differenti. Le colonie, prelevate e purificate, sono costituite, per certo, da batteri biodegradanti diesel marino.

La prassi microbiologica, fatta di estrazione del DNA, amplificazione dello stesso, sequenziamento genico pro-filogenesi, ha avuto regolarmente corso sulle crescite microbiche. Sono emersi 12 ceppi, denominati MJ e numerati dall’1 al 12: MJ1-MJ12. Ogni ceppo purificato, inoculato in terreno liquido LB, sempre a 28°C e 130 r/min, ma per 16 ore, in questo caso. Di tali colture, 4 mL trasferiti in beute pronte con 71 mL di medium minerale ed olio diesel filtrato 10 g/L.

I ricercatori hanno, così, valutato, mediante spettroscopia UV, le capacità di degradazione batteriche. Con l’ausilio, invece, di gas cromatografia e spettrometria di massa, ecco ottenuta l’analisi dei prodotti di degradazione, tutt’altro che trascurabili, in un approccio eticamente corretto.

Tutti gli optima del megaterium

La totalità dei ceppi inclusi nelle prove sperimentali ha dimostrato omogenea capacità degradativa, nei confronti del diesel marino, con efficienza compresa tra 4.77% e 26.54%, dopo il quinto giorno d’incubazione. Tra tutti, il migliore è MJ4. Analizzata la sua sequenza genica, sulla scorta delle sequenze BLAST (strumento di ricerca di allineamento locale), è emersa una similiturdine del 99% con Bacillus megaterium GC61 (KF158230).

E’ sul Bacillus megaterium MJ4, perciò, che i ricercatori hanno focalizzato attenzione ed indagini, allo scopo di definire tutti gli optima sperimentali, in grado di garantire esito favorevole alla remediation marina. E via, dunque, a prove di temperatura su 100 mL di coltura, tra 16°C e 32°C. Prove di pH, in un range compreso tra 6.25 e 9.5. Prove di concentrazione dell’inquinante-target: concentrazione iniziale di olio diesel tra 5 e 25 g/L. Quindi differenti nutrienti batterici K₂HPO₄/NH₄NO₃ in rapporto tra 0 e 4:3.

Specifiche batteriche

Risulta, così, che la percentuale di biodegradazione del diesel marino salga dal 2% al 14.94% al crescere della temperatura, da 16°C a 28°C. Decresce, però, a temperature superiori a 28°C. Ugualmente, la percentuale di biodegradazione sale, e rapidamente, da 8% a 55%, in condizioni di pH crescente, ovvero da 6 a 8.8.

Si evince, inoltre, che il Bacillus megaterium (Figura 2) deve preferire concentrazioni di partenza dell’inquinante paria 25 g/L. Le mansioni biodegradative del batterio (che per esso sono solo essenziali meccanismi metabolici), si giovano anche di quantità crescenti di fosforo.

Percentuali di biodegradazione superiori, al 17.31%, coincidono con un rapporto K₂HPO₄/NH₄NO₃ w/w pari a 4:3. La tolleranza batterica all’inquinante, infatti, è correlata alle quote di azoto e fosforo nel mezzo. Certo, tenere tale rapporto entro limiti più stretti, significa scampare rischi di eutrofizzazione e contenere i famigerati costi. L’equilibrio costi/benefici si trova in una efficienza di biodegradazione del 15.51% ed un rapporto P/N di 2:3.

Ed i prodotti di degradazione?

L’analisi dei prodotti di degradazione del diesel marino ha fornito prove per le quali ogni picco gas-cromatografico scompaia, nel campione biologico, in presenza di Bacillus megaterium MJ4. Esso, infatti, degrada tutti i normali alcani del diesel (C10-C20), nell’arco di 5 giorni. Secondo Punniyakotti e colleghi, invece, il Bacillus subtilis A1 avrebbe capacità degradative analoghe, ma su catene idrocarburiche di più varie lunghezze.

Aria al megaterium!

Tutto considerato, la percentuale di biodegradazione del petrolio in acqua, operata dal Bacillus megaterium, cresce al crescere della concentrazione dell’inquinante. E questo lo porta, dritto dritto, verso la gloria che spetta ai migliori agenti di bioremediation.

Poichè, però, i principali enzimi degradativi, di idrocarburi saturi ed aromatici, sono delle ossigenasi, è d’uopo che lavorino in aerobiosi. Perciò, se la concentrazione iniziale dell’inquinante è troppo elevata, tanto da ricoprire la superficie marina di scambio con l’atmosfera, la bioremediation completa è addirittura rischiosa per l’ecosistema marino. Non fosse altro che per la presenza, in quel caso importuna, di fonti d’azoto e fosforo impossibilitate, in un simile frangente, a sostenere qualsivoglia degradazione. Restando, però come fonte di ipernutrizione algale, nota come eutrofizzazione. La lenta morte per sovraffollamento e soffocamento dei bacini idrici terrestri.

Come dire, il rimedio c’è, purchè il male non sia davvero estremo.