La riparazione del DNA a bordo della ISS grazie a CRISPR/Cas9

Tra i tanti traguardi di questa prima metà del 2021 è bene menzionare il raggiungimento della tecnica di editing genomico CRISPR/Cas9, per la prima volta, sulla ISS a servizio della medicina spaziale. Tutto è partito dal progetto Genes in Space, che ha permesso di utilizzare la CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) con successo all’interno della Stazione Spaziale Internazionale, nell’ambito dell’esperimento Gene in Space-6.

Ormai da molto tempo è noto che gli astronauti, date le condizioni di vita estreme e l’aumentata esposizione a fattori di rischio, sono soggetti a pericolose alterazioni del DNA. In particolare, le particelle ionizzanti che caratterizzano i raggi cosmici possono creare danni multipli e localizzati. Fra questi, i più pericolosi sono le cosiddette rotture del doppio filamento (DSB), in cui vengono idrolizzate le ossature fosfatiche di entrambi i filamenti di DNA. Per il percorso di riparazione subito dopo il DSB, il riconoscimento iniziale della rottura del DNA è molto importante, insieme all’assemblaggio dei fattori di riparazione del DNA nel sito di rottura. In tal senso, lo studio pubblicato su Plos One rappresenta un progetto pionieristico: per la prima volta nella storia è stata condotta una trasformazione genetica interamente nello spazio, a bordo della Stazione Spaziale Internazionale (ISS), utilizzando la tecnica CRISPR/Cas9. In questo modo, rispetto a studi precedenti sul ruolo della microgravità nel meccanismo di riparazione del DNA, è stato possibile studiare l’induzione della rottura DSB e la riparazione interamente nell’ambiente di microgravità. Questo suggerisce in che modo vengono influenzate le decisioni del nostro organismo circa la riparazione delle sequenze di DNA danneggiate.

Lo studio

Il metodo utilizzato dagli scienziati coinvolti nello studio pubblicato su Plos One, si è concentrato sull’utilizzo di una strategia di mutagenesi basata su CRISPR per la generazione mirata di DSB in un locus genomico definito. In particolare, è stata effettuata la prima trasformazione genica di Saccharomyces cerevisiae con materiale genetico esogeno; durante l’editing del genoma mediato da CRISPR/Cas9, la nucleasi Cas9 è diretta da un RNA guida ingegnerizzato per riconoscere e creare un DSB in un sito specifico nel genoma. Quindi, sono state apportate modifiche alla sequenza del DNA nel sito del DSB attraverso inserzioni o delezioni casuali nel sito di rottura; inoltre, sono state apportate modifiche specifiche alla sequenza del DNA attraverso un modello di riparazione ingegnerizzato.

In questo sistema specifico, auxotrofi Scerevisiae privi di un gene URA3 funzionale (necessario per la biosintesi dell’uracile) sono stati trasformati con il plasmide pVG1; quest’ultimo, esprime un URA3 funzionale per la selezione positiva dei trasformanti, l’enzima Cas9 e un RNA guida che indirizza Cas9 al gene che richiede l’adenina 2 (ADE2). In questo modo, i Scerevisiae diventano rossi a causa dell’accumulo di precursori purinici nel vacuolo, consentendo l’identificazione visiva delle colonie mutanti (Fig. 1); inoltre, il plasmide pVG1 contiene uno stampo di riparazione che introduce codoni di stop precoci nel gene ADE2.

trasformazione genica a bordo della ISS
Figura 1 –  Editing del genoma CRISPR adattato per l’uso a bordo della ISS [https://journals.plos.org]

La scelta del percorso di riparazione è stata successivamente determinata analizzando la sequenza del DNA nel sito di rottura per analizzare se la sequenza includesse la sequenza del modello di riparazione prevista.  Questo tipo di analisi della sequenza del DNA è stata eseguita utilizzando metodi che sono stati precedentemente stabiliti per funzionare nello spazio, in particolare l’amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR), seguita dal sequenziamento dei nanopori.

Come è stato possibile trasformare Saccharomyces cerevisiae a bordo della ISS?

La preparazione delle cellule di Scerevisiae per lo studio è stata eseguita con protocolli standard per facilitare il trasporto e la trasformazione a bordo della ISS.

Le cellule di lievito sono state prima coltivate sulla Terra ad una concentrazione di circa 1×10 8 cellule per millilitro, pellettizzate mediante centrifugazione e congelate a -80°C per la spedizione all’ISS, o mantenute come controlli a terra. Successivamente, a bordo della ISS (e parallelamente a terra), i pellet sono stati scongelati e risospesi prima di essere combinati con una miscela di trasformazione che includeva glicole polietilenico, acetato di litio e il plasmide pVG1. Il termociclatore miniPCR è stato, quindi, utilizzato come blocco termico per indurre la trasformazione. Dopo la trasformazione, le cellule sono state trasferite in piastre di Petri contenenti agar sintetico privo di uracile per la crescita e la selezione dei trasformanti. Per piastrare le cellule in microgravità, piccoli volumi di coltura liquida (~ 20 μl) sono stati trasferiti sulla superficie dell’agar utilizzando una micropipetta. Trasferendo piccoli volumi, la tensione superficiale era sufficiente a mantenere la sospensione di lievito attaccata all’agar prima di essere diffusa con la forza di un divaricatore di plastica sterile. I controlli a terra sono stati preparati in parallelo utilizzando gli stessi metodi.

L’astronauta della Nasa Christina Kock mentre esegue la procedura sperimentale a bordo della ISS
Figura 2 – L’astronauta della NASA Christina Kock mentre esegue la procedura sperimentale a bordo della ISS [https://journals.plos.org]

Risultati

Secondo i ricercatori coinvolti nello studio, l’utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 per studiare la riparazione del DNA nello spazio presenta numerosi vantaggi rispetto ai modelli precedentemente stabiliti. Innanzitutto, questo sistema non utilizza radiazioni o altri reagenti che causano danni al DNA diffusi e aspecifici. Inoltre, poiché il DSB viene generato in una posizione precisa nel genoma, qualsiasi cambiamento nella sequenza del DNA dopo la riparazione può essere facilmente identificato e monitorato utilizzando metodi precedentemente convalidati sull’ISS, ovvero la sopracitata PCR e il sequenziamento del DNA.

Nonostante il traguardo raggiunto di una migliore comprensione della scelta del percorso di riparazione del DNA in condizioni di microgravità, l’esperimento presenta delle limitazioni degne di nota. Innanzitutto, i DSB generati da Cas9 sono molto più semplici di quelli generati da particelle ad alto LET trovate nello spazio. Inoltre, poiché la complessità del danno al DNA può influenzare la scelta del percorso di riparazione, il modello di studio potrebbe non ricapitolare completamente le condizioni che si possono trovare al di fuori della magnetosfera terrestre.

Infine, i dati di sequenziamento dei nanopori dalle colonie rosse di volo e di terra mostrano una differenza interessante. Sebbene più del 90% delle letture dai controlli a terra si allineano alla sequenza del modello di riparazione ade2, le letture di volo mostrano una maggiore eterogeneità, con una porzione significativa che si allinea alla sequenza wildtype di ADE2. Questa maggiore eterogeneità potrebbe essere semplicemente dovuta a differenze procedurali nel campionamento eseguito sulla ISS rispetto a come sono state campionate a terra. In alternativa, questa eterogeneità può riflettere le differenze biologiche tra le colonie modificate da CRISPR/Cas9 di volo e di terra. Sono, quindi, necessari ulteriori studi per spiegare completamente questa osservazione. Per i ricercatori:

«Il nostro studio ha il potenziale per influenzare sia la nostra comprensione dei processi biologici di base nella microgravità, sia la futura esplorazione e colonizzazione dello spazio e sottolinea l’importanza della ricerca di biologia molecolare di base a bordo dell’ISS National Lab».

Fonti

Crediti immagini

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