Analisi genomica e trascrittomica delle cellule batteriche

L’avvento delle scienze omiche ha rivoluzionato lo studio di tutte le discipline dell’ambito biologico, tra cui la microbiologia: le cellule microbiche sono da considerarsi come sistemi unici in cui ogni elemento dipende da tutto il resto. In altre parole, è sufficiente non solo conoscere un gene ed il suo funzionamento oppure una via metabolica ed i suoi prodotti bensì anche apprendere la connessione del sopracitato gene con altri geni e della sopracitata via metabolica con le altre vie metaboliche ed i rispettivi prodotti per riconoscerne l’effettivo significato e l’effettiva valenza nell’ambito fenotipico.

In questo articolo, ci si propone di spiegare come, in seguito ai primi lavori di sequenziamento dei genomi batteri, lo sviluppo della trascrittomica abbia permesso di effettuare un’analisi di espressione genica delle cellule batteriche. 

Le scienze omiche

Grazie allo straordinario progresso tecnologico nei campi della biologia molecolare, della genetica e della bioinformatica, negli ultimi venticinque anni circa, si è assistito alla nascita delle cosiddette scienze omiche. Queste includono la genomica, la trascrittomica, la proteomica e la metabolomica. Il suffisso -oma è utilizzato per indirizzare gli oggetti di studio di tali campi come il genoma, il trascrittoma, il proteoma ed il metaboloma, rispettivamente.

In particolare, la genomica è la scienza che studia la struttura e la funzione del genoma e provvede alla caratterizzazione ed alla quantificazione dei geni del genoma di un determinato organismo; la trascrittomica è la scienza che studia l’insieme delle molecole di RNA messaggero (mRNA) ma, talvolta, può comprendere anche tutte le molecole di RNA, comprese, cioè, le molecole di RNA non codificanti (ncRNA) di una singola cellula, di un tessuto oppure di un organismo. È bene sottolineare che, a differenza del genoma che, escludendo le mutazioni, è pressappoco costante per una data linea cellulare, il trascrittoma può variare al variare delle condizioni ambientali e/o dello stato in cui una cellula si trova. In aggiunta, la proteomica è la scienza che studia l’insieme delle proteine di una cellula, di un tessuto oppure di un organismo. Il metaboloma rappresenta l’insieme di tutti i metaboliti di una cellula, di un tessuto, di un organo oppure di un intero organismo. La metabolomica, quindi, è la scienza che studia tutti i processi chimici che coinvolgono i metaboliti.

Complessivamente, le scienze omiche si pongono come obiettivo quello di identificare, caratterizzare e quantificare tutte le molecole biologiche che sono coinvolte nella struttura e nella funzione di una cellula, di un tessuto o di un organismo. 

Il sequenziamento del genoma batterico e l’evoluzione delle tecniche di trascrittomica

Nel 1995, in un articolo pubblicato su Science, veniva spiegato il sequenziamento del genoma del batterio Haemophilus influenzae, un coccobacillo Gram negativo patogeno per l’uomo. Fu osservato che il genoma di H. influenzae è composto da 1.830.137 coppie di basi e da circa 1.743 geni (dai un’occhiata a questo articolo). Da allora, il sequenziamento del genoma batterico è diventato un obiettivo relativamente facile da perseguire, poiché lo sviluppo di macchine sequenziatrici di nuova generazione hanno ridotto in maniera impressionante i tempi ed i costi del sequenziamento. L’analisi delle sequenze genomiche, inoltre, ha permesso di identificare presunti nuovi geni. La conoscenza di un’intera sequenza genomica batterica ha consentito di espandere la ricerca verso la caratterizzazione dei trascritti genici batterici. E, quindi, come per il sequenziamento del genoma, anche l’analisi trascrittomica ha subito una importante evoluzione. 

La trascrittomica 

Le tecniche di trascrittomica, utilizzate per determinare le molecole di RNA, includono l’uso di DNA microarray e la più recente RNA-Seq. Un microarray è un insieme di sonde di DNA adese ad una superficie solida. Le molecole di mRNA da identificare vengono estratte dalla cellula e convertite in cDNA (target) mediante l’enzima trascrittasi inversa e poi marcate con sostanze fluorescenti. 

Figura 1: Principio della tecnica del DNA microarray.

L’ibridazione tra il cDNA target e la sonda adesa alla matrice è facilmente rilevata dal segnale di fluorescenza rilasciato dalla molecola target in seguito alla ibridazione. 

La presenza di artefatti di cross-ibridazione e la necessità di conoscere il genoma di riferimento a priori per la costruzione delle sonde complementari alle molecole di cDNA target hanno permesso l’avanzamento dell’RNA-Seq, rendendo la trascrittomica una scienza basata sui metodi di sequenziamento.

Le tecnologie di next-generation sequencing hanno permesso lo sviluppo dell’RNA-sequencing (RNA-Seq) da cui si possono ottenere corte sequenze chiamate read. Tali read sono utilizzate per ricostruire il trascrittoma mediante due modalità principali: le read, tra loro assemblate, possono essere allineate ad un genoma di riferimento (transcriptome assembly genome guided) oppure, se non è disponibile un genoma di riferimento per la ricostruzione del trascrittoma, si allineano le sequenze read tra loro per determinare regioni di sovrapposizione che potrebbero determinare read continue (contig) e quindi rappresentare una regione più consistente del trascrittoma (de novo assembly).

Qualunque sia la strategia utilizzata per l’assemblaggio delle read in un esperimento di RNA-Seq, è necessario l’utilizzo di programmi bioinformatici per valutare la qualità delle read derivanti dal sequenziamento ed il corretto assemblaggio. La ricostruzione del trascrittoma mediante la tecnologia di RNA-Seq permette di identificare trascritti derivanti da splicing alternativo, di caratterizzare modificazioni post-trascrizionali e di rivelare cambiamenti nell’espressione genica. 

Figura 2: Principio dell’RNA-Seq.

Sebbene sia ancora lunga la strada da percorrere per comprendere appieno le interazioni tra i singoli elementi di una cellula o di un organismo, le scienze omiche e lo sviluppo delle relative tecnologie hanno dato una svolta alla microbiologia in particolare ed alla biologia tutta. 

Fonti:

  • Vailati-Riboni, M., Palombo, V., & Loor, J. J. (2017). What Are Omics Sciences?. In Periparturient Diseases of Dairy Cows (pp. 1-7). Springer, Cham.
  • Maffia, M., Conte, L., Greco, M., Maffia, M. C., Simeone, P., & Vergara, D. (2017). OMICS Sciences: toward omics personalized medicine. JDREAM. Journal of interDisciplinary REsearch Applied to Medicine, 1(1), 7-20.
  • Immagine 1 da https://microbenotes.com/dna-microarray/
  • Immagine 2 da https://www.semanticscholar.org/paper/Functional-genomics-(-II-)-%3A-Common-technologies-Huerta-Burke/04ed7b5e4b034da7af7253f6a104451b03f559a2
  • Immagine in evidenza da kibowbiotech.com

Commenta per primo

Rispondi