Corpi di inclusione, sfide nella produzione di proteine recombinanti

Astratto

Le proteine ricombinanti (PR) sono sempre più importanti per le applicazioni industriali e Escherichia coli è l’ospite batterico più utilizzato per la loro produzione. L’espressione di proteine eterologhe nei batteri spesso porta alla formazione di proteine inattive e insolubili che si accumulano come aggregati proteici intracellulari chiamati corpi di inclusione, che sono aggregati insolubili di proteine sovraespresse nelle cellule. Alcune proteine sono inclini all’aggregazione e altre no. Le proteine che non si aggregano sono solitamente ripiegate correttamente e mantengono la loro attività biologica.

Abstract

Recombinant proteins are becoming increasingly important for industrial applications, where Escherichia coli is the most widely used bacterial host for their production. Recombinant protein expression in bacteria often results in the formation of both inactive and insoluble protein that accumulates as intracellular protein aggregates called inclusion bodies. Inclusion bodies are insoluble aggregates of overexpressed recombinant protein in the bacterial cells. Some proteins are prone to aggregation and others are not. The proteins that don’t aggregate usually are correctly folded and retain biological activity.

Introduzione

Le proteine ricombinanti sono sempre più importanti come enzimi e proteine non catalitiche (ad esempio anticorpi, ormoni, fattori, vaccini) per applicazioni industriali e agricole. E.coli è l’ospite batterico più popolare per la produzione di proteine eterologhe grazie al su rapido tasso di crescita, con un tempo di generazione di 20 minuti in condizioni ottimizzate, agli strumenti di manipolazione molecolare ben sviluppati e alla conoscenza approfondita della sua biologia, e alla capacità di raggiungere un’elevata densità cellulare utilizzando reagenti di coltura poco costosi.

Figura 1. Produzione di proteine ricombinanti (Fonte: Bacteria Expression Systems, 2022)

Una ricerca di Singh, A., et al. (2015), spiega che l’espressione ad alto livello di proteine ricombinanti in E.coli spesso si traduce in un’alterazione della qualità della vita. L’aggregazione di molecole proteiche espresse in corpi di inclusione, inoltre, definisce che l’uso di temperature elevate durante l’espressione delle proteine, l’alta concentrazione di induttori e l’espressione sotto sistemi di promotori forti spesso portano all’espressione della proteina desiderata a una velocità di traduzione elevata.

Questo esaurisce il sistema di controllo della qualità delle proteine batteriche e le molecole proteiche parzialmente ripiegate e mal ripiegate si aggregano per formare corpi di inclusione. Anche l’ambiente ridotto del citosol batterico, la mancanza di chaperoni eucariotici e di macchinari post-traduzionali contribuiscono alla formazione dei IB. Anche se negli ultimi anni i corpi di inclusione batterici sono stati segnalati per fornire molte applicazioni.

Formazione di corpi di inclusione in E. coli: Fattori

Tutti gli organismi viventi hanno evoluto un sofisticato meccanismo per mantenere l’omeostasi proteica. L’omeostasi proteica si riferisce al controllo della concentrazione, della conformazione, delle interazioni di legame e della localizzazione delle singole proteine che compongono il proteoma, riadattando la biologia innata della cellula.

La formazione di corpi di inclusione proteica nelle cellule di E. coli è il risultato di uno squilibrio tra il corretto ripiegamento, l’aggregazione e la degradazione delle proteine. È legata a molti fattori, come il metabolismo della cellula ospite, i macchinari per la sintesi e la modifica delle proteine, le proprietà delle proteine bersaglio e le condizioni ambientali.

Secondo Gill et al., ; Zeng e Yang, (citati in Bhatwa A, et al., 2021) la formazione di IB (Inclusion bodies – corpi di inclusione in inglese) può essere innescata da un’elevata velocità di espressione delle proteine, che rappresenta l’apice delle pipeline di produzione di PR.

Questo obiettivo viene spesso raggiunto costruendo vettori di espressione con promotori forti (ad esempio promotori T7 e Lac), utilizzando plasmidi con un elevato numero di copie, ottimizzando l’uso dei codoni o ingegnerizzando i ceppi ospiti di E. coli per una crescita rapida.

Tuttavia, quando la velocità di espressione di una proteina eterologa supera la capacità delle cellule ospiti di gestire le modifiche post-traduzionali e il ripiegamento della proteina, la proteina bersaglio si ripiegherà sempre più male e si aggregherà in IB, poiché i residui idrofobici sepolti nella proteina nativa vengono esposti sulla loro superficie.

Inoltre, le cellule ospiti non possono mantenere l’espressione della proteina a livelli così elevati a causa dello stress cellulare e dell’onere metabolico derivante dall’aumento della richiesta di energia.

Winkler et al. (citato in Bhatwa A, et al., 2021) descrivono che anche le condizioni ambientali, come la temperatura e il pH della coltura, influenzano la formazione di IB durante la produzione di proteine ricombinanti in E. coli.

L’effetto dello stress termico a 45 °C sull’induzione dell’aggregazione della luciferasi ricombinante in E. coli è stato riportato in precedenza, così come la capacità delle condizioni di pH fisiologico (pH = 7,5) di ottenere un effetto benefico sull’espressione eterologa della sfingomielinasi-D di Boophilus microplus in E. coli. In base al ragionamento sopra esposto, l’adattamento delle condizioni di coltura è un approccio che viene spesso utilizzato come soluzione per ridurre al minimo la formazione di IB delle proteine ricombinanti in E. coli.

Prevenire la produzione di corpi di inclusioni in E.coli

Nell’articolo di Daugherty, 2021, si spiega che una delle prime strategie per evitare la formazione di IB consiste nel ridurre la temperatura delle colture batteriche, generalmente tra 16 °C e 20 °C, e nell’utilizzare IPTG a concentrazioni inferiori. In genere, uno screening pilota con diverse concentrazioni/temperature di IPTG aiuta a identificare le condizioni ottimali.

Più recentemente, per ridurre la formazione di IB, è stato suggerito un metodo di shock freddo. Questo metodo consiste nell’incubare la coltura per 1 ora a 4 °C o in ghiaccio subito prima dell’aggiunta dell’IPTG o dell’induttore.

Il trattamento con shock freddo costringe il metabolismo batterico a rallentare e provoca la formazione di proteine da shock freddo; l’effetto complessivo è quello di rallentare la sintesi proteica, portando all’espressione di proteine in forma solubile e prevenendo la formazione di corpi di inclusione.

Strategie per controllare e ridurre al minimo la formazione di corpi di inclusione

Le ricerche di Castellanos-Mendoza et al., Bushmarina et al., e Rosano e Ceccarelli- , Kauer et al ., (citate in Bhatwa A. et al., 2021) descrivono rispettivamente alcune strategie per controllare e ridurre al minimo la formazione di IB di proteine ricombinanti in E. coli. come:

l’uso di un tampone per controllare il pH del terreno di crescita, che funziona come controllo delle fluttuazioni di pH per i corretti stati di protonazione delle proteine; senza fluttuazioni, le proteine rimangono chimicamente stabili.
Aggiungere cofattori proteici nel terreno di coltura, poiché molte proteine necessitano di cofattori per il loro corretto ripiegamento, come i metalloenzimi.
l’uso di promotori deboli riduce il tasso di espressione delle proteine migliorando l’equilibrio tra la sintesi e il ripiegamento delle proteine, con un conseguente minor carico metabolico.

Daugherty, 2021, spiega anche che la formazione di IB non è sempre un fatto negativo. I corpi di inclusione contengono una grande quantità di proteine sovraespresse di interesse (in elevata purezza); in media, i corpi di inclusione hanno generalmente più proteine delle proteine solubili per litro di coltura di E. coli.

In effetti, molti processi inducono deliberatamente la formazione di corpi di inclusione da parte della loro proteina di interesse per ottenere rese più elevate. Alcune proteine sono estremamente sensibili alle proteasi intracellulari e le proteine espresse come IB sono protette dall’azione delle proteasi.

Inclusion Body Purification & Protein Refolding, n.d., un fornitore di servizi per le proteine all’avanguardia, descrive una metodologia per la purificazione dei IB che è riassunta nel grafico seguente:

figura 2. *purificazione dei corpi di inclusione (fonte: Inclusion Body Purification & Protein Refolding, n.d.)*

Conclusioni

Sebbene i batteri in generale e soprattutto E.coli siano microrganismi piuttosto semplici a livello cellulare, in quanto non presentano la complessità strutturale di una cellula eucariotica, la loro manipolazione, soprattutto a fini industriali o ambientali, suggerisce una serie di condizioni specifiche per l’ottenimento di proteine eterologhe da essi prodotti, in quanto sono soggetti a modifiche del loro macchinario metabolico come i corpi di inclusioni.

Nei bioprocessi, è necessario effettuare esperimenti per migliorarne e ottimizzarne la qualità, poiché lo scaling up dei processi biologici richiede costi economici elevati dovuti all’uso di determinati terreni di crescita, induttori e catalizzatori, all’impiego di temperature specifiche e ad altri meccanismi di scaling up come l’agitazione, il tipo di reattore e i metodi di estrazione e purificazione delle proteine.