Enterotossina non emolitica di Bacillus cereus: apripista per screening più rapidi

Le tossinfezioni alimentari sono un pericolo costante e silenzioso, nascosto nei piatti più succulenti, sia in casa che fuori. La preparazione dei cibi non è, infatti, affare da poco. Come la loro successiva conservazione. Errori ed intempestività posso trasformare le pietanze in bocconi avvelenati. Il Bacillus cereus, per esempio, produce, tra le altre, una enterotossina responsabile di spiacevoli sindromi intestinali. Ma grazie ad un nuovo approfondimento funzionale su tale prodotto batterico si intravede uno sveltimento nelle future indagini tossicologiche.

Il Bacillus cereus e la sua enterotossina

Cereus per il “color della cera” delle sue colonie su piastra, dalle superfici opache come gocce colate da una candela lasciata ad ardere (Fig.1). Sono bacilli, cioè bastoncini, sottili e diritti oppure leggermente ricurvi, dalle estremità tozze. A volte formano insieme delle corte catene, altre volte circolano come individui singoli. Circolano, sì. Sono muniti di flagelli peritrichi (cioè circondanti l’intero perimetro batterico) e dotati, perciò, di movimento. Sciamano, per la precisione, su superfici solide e semi-solide, biotiche ed abiotiche.

Bacillus cereus formante colonie su piatrs di agar sangue, capace di produrre enterotossina.
Figura 1 – Bacillus cereus beta-emolitico, su piastra di agar sangue.
Fonte: https://www.lifeder.com/bacillus-cereus/

Il Bacillus cereus è un anaerobio facoltativo che può formare endospore protettive, in condizioni ambientali sfavorevoli, senza neppure l’ausilio di una capsula. Questi bacilli crescono facilmente a temperature che variano dai 5 ai 50°C e risultano resistenti persino alla penicillina.

La virulenza del cereus

Ogni microrganismo ha le sue cartucce da sparare per conquistare nuovi territori di diffusione ed il Bacillus cereus non ne è affatto sprovvisto. I suoi fattori di virulenza rappresentano, infatti, armi d’assalto in grado di superare le barriere difensive fisiche, biochimiche e spesso genetiche dell’ospite. Il batterio in questione può contare, in particolare, su:

  • 2 complessi enterotossici (emolisina BL ed enterotossina non emolitica NHE);
  • emolisine e citolisine (cereolisina O e citotossina K Cyt K);
  • enterotossine minori (Ent FM, Ent Bcet);
  • fosfolipasi C;
  • collagenasi;
  • tossina emetica.

Alcuni batteri sono, infatti, in grado di sintetizzare molecole nocive, dette tossine, che nel tempo sono poi state distinte in due grandi tipologie:

  • endotossine di natura lipidica, di solito componenti strutturali rilasciate in seguito alla lisi della cellula batterica;
  • esotossine di natura proteica, quindi idrosolubili e rilasciate nel mezzo extra-cellulare da cellule pienamente vitali.

Esistono molte esotossine batteriche. Esse hanno, spesso, ottime proprietà antigeniche, sono termolabili e deperibili per azione dei succhi gastrici. Eccezion fatta per l’enterotossina stafilococcica e la tossina botulinica. I tipi di interazione tra tossine proteiche e cellule dell’ospite si concentrano, prevalentemente, su due fronti di combattimento: la membrana cellulare ed il citosol, dove queste sostanze interferiscono con i meccanismi metabolici di regolazione enzimatica. Quando le tossine colpiscono le membrane cellulari si definiscono esfoliative oppure emolitiche. Le enterotossine emolitiche formano pori sulla membrana cellulare, provocando un prevedibile scompenso nel normale equilibrio degli scambi cellulari con il mezzo esterno. L’alterazione è tale da indurre, per la sicurezza generale dell’intero organismo, l’apoptosi: la morte programmata della cellula guasta.

Bacillus cereus: arma a doppia sindrome

Il Bacillus cereus è un microrganismo ubiquitario, ma contamina prevalentemente il suolo e la polvere. La trasmissione all’organismo umano si realizza attraverso l’ingestione di alimenti contaminati che, dopo la cottura, non siano stati correttamente conservati. Se un alimento processato e cotto viene, infatti, lasciato freddare lentamente a temperatura ambiente, anzichè essere rapidamente portato a temperatura di refrigerazione (4°C in frigoconservazione), diversi batteri se ne gioveranno. Tra questi, il Bacillus cereus che, durante i successivi e tardivi sbalzi termici, abbandonerà la forma vegetativa per passare a quella di spora.

In alcune specie batteriche, l’evoluzione ha selezionato individui con capacità di sopravvivenza speciali in condizioni ambientali sfavorevoli, o, addirittura, non compatibili con la vita. La sporogenesi è dunque la capacità di produrre strutture di resistenza: le spore. Una cellula madre darà vita, al suo interno, a semi di esistenza in stato di quiescenza che attendono solo una buona occasione.
La quiescenza metabolica, in realtà, cancella l’urgenza riproduttiva, rimandandola a tempi migliori, e concentra le risorse batteriche nella difesa del preziosissimo materiale genetico. Il suo libretto d’istruzioni. Sopravvivere a mali fisici (irraggiamento e calore di riscaldamento o cottura) e chimici (disinfettanti per superfici alimentari) è tutto ciò che si richiede.

A pericolo cessato, con temperature favorevoli, distrattamente applicate dal manipolatore alimentare di turno, le spore fioriranno esprimendo nuovi individui cellulari in grado di produrre tossine. In piatti, all’occhio, perfettamente allettanti. Il tenace batterio sarà, così, responsabile di due tipi di complicazioni patologiche nell’uomo: una sindrome gastrica (emetica) ed una intestinale (diarroica).

Ogni esotossina ha i suoi effetti

L’emolisina BL è prodotta dal 60% dei ceppi di Bacillus cereus e possiede attività emolitica, dermonecrotica ed enterotossica. L’enterotossina non emolitica NHE è prodotta dal 100% dei ceppi e risulta composta da tre subunità: NheA, NheB, NheC. Anch’essa ha capacità enterotossica e, secondo Liu e colleghi, induce apoptosi nelle cellule epiteliali. L’emolisina cereolisina O è una tossina termolabile la cui attività è inibita dal colesterolo di membrana. La citolisina nota come citotossina K è nociva per le cellule epiteliali di rivestimento enterico ed esplica azione emolitica simile alla leucocidina di Staphylococcus aureus. Fu questa che, mediante il ceppo NVH 391-98 di Bacillus cytotoxicus, provocò una grave epidemia in Francia nel ’98. Ma i bacilli possiedono anche alcune fosfolipaci C, responsabili dei sintomi sistemici.

Sindrome emetica da Bacillus cereus

La tossina emetica, nota come cereulide, è un peptide di 12 aminoacidi sintetizzato da un complesso enzimatico non ribosomiale, la cereulide sintetasi. Sostanza estremamente termostabile (fino a 120°C per 90 minuti), resiste anche ad un ampio range di pH (da 2 a 11) e all’attacco degli enzimi proteolitici preposti. Funge da ionoforo del potassio, altera il gradiente elettrochimico ed i mitocondri. E’ questa classe di sostanze che genera la nota “sindrome emetica“, che si fa ricordare per sintomi dovuti alla stimolazione dei recettori 5-HT3 sui neuroni vagali afferenti. Nausea, vomito, crampi addominali compaiono dopo già 1- 6 ore dall’ingestione del cibo contaminato. Si definisce infatti come “sindrome a ridotta incubazione”. La tossina, in questo caso, è già formata nell’alimento prima dell’ingestione, tuttavia la concentrazione batterica critica per la sua pre-produzione deve raggiungere 105– 108cfu/g di cibo.

Sindrome diarroica da Bacillus cereus

Lo stesso bacillo può rendersi responsabile di un’altra sindrome. A livello enterico, si manifesta con crampi addominali e diarrea, dopo 8-16 ore dall’ingestione dell’alimento contaminato. La così detta “sindrome diarroica“. A causare, biochimicamente, questo differente quadro sintomatologico sono varie enterotossine termolabili. Queste, però, si generano dopo ingestione, nel tenue dell’ospite. La concentrazione batterica venefica, in questo caso, è pari a 104-109 cfu/g di cibo. Ad oggi i ricercatori guidati da Stenfors hanno identificato tre principali tipi dell’enterotossina, prodotta dopo l’ingestione: citotossina K, enterotossina non emolitica NHE ed emolisina BL. Le ultime due sono anche risultate tossine tripartite.

Enterotossina non emolitica e sistema di sintesi “cell-free”

I ceppi di Bacillus cereus spesso producono tossine multiple simultaneamente. Nel tempo, si sono resi necessari nuovi metodi di caratterizzazione di tali pericolose tossine, al fine di sviluppare strumenti diagnostici per la loro individuazione tempestiva. A questo è valso il Sistema di Sintesi Proteica “Cell-Free” (Cell-Free Protein Synthesis, CFPS). Si tratta di un sistema privo di cellule per esprimere le proteine, oggetto di studio, rapidamente ed in elevate quantità. I vantaggi sono, inoltre, dovuti alla semplificazione -pur nella completezza- del sistema di studio in vitro delle reazioni biologiche. Questo sistema si è rivelato un metodo efficace tanto nella sintesi quanto nella caratterizzazione funzionale delle tossine proteiche.

Lo studio dell’enterotossina NHE

Nell’ultimo lavoro di Franziska Ramm e colleghi, i ricercatori hanno conseguito la sintesi in vitro della tossina NHE funzionalmente tripartita. Per la prima volta, i dati hanno dimostrato che i sistemi in vitro CFPS eucariotici offrono una via di sintesi funzionale attiva e multicomponente delle tossine, con metodo rapido ed efficiente.

Le reazioni di sintesi CFRS hanno avuto luogo a partire da un lisato ben espresso in proteine ed attivo, derivato da cellule ovariche di criceto cinese (Chinese hamster ovary cells CHO-K1). La sintesi delle nuove “proteine difficili da esprimere” è seguita a reazioni accoppiate di trascrizione/traduzione. Volume di reazione finale pari a 20-30 μL.

Sulla scorta dei dati forniti da Brödel e colleghi, i ricercatori hanno composto plasmidi specifici per la codificazione di ognuna delle 3 subunità della tossina NHE di Bacillus cereus. Essi sono poi stati usati sia separatamente, sia in combinazione di 2 o 3, per verificarne l’efficacia nella corretta espressione della tossina tripartita. Come background di controllo, i ricercatori hanno fatto uso di un modello NTC (No Template Control): una miscela proteica espressa senza aggiunta di DNA-modello (template). I geni codificanti per ogni subunità della tossina sono emersi da una sintesi de novo, per mezzo di Biocat GmbH (strumento per sintesi genica). Le sequenze geniche coinvolte nella sintesi de novo appartengono al ceppo ATCC 14579 di Bacillus cereus.

Risultati e scoperte

Finora, gli studi condotti su proteine multicomponenti avevano avuto luogo in procarioti e lisati di linee cellulari umane. Questo nuovo studio, invece, dimostra l’efficacia del sistema di sintesi proteica in vitro cell-free CFPS negli eucarioti. Non solo per l’espressione proteica in sè, ma anche per la caratterizzazione funzionale delle singole subunità delle tossine tripartite. Lindback e colleghi, in passato, hanno accertato che le 3 subunità tossiniche dovessero essere contemporaneamente presenti. Il rapporto molare reciproco doveva attestarsi su 10:10:1 [A:B:C], per garantire la massima attività funzionale del complesso NHE di Bacillus cereus.

In questo lavoro, invece, i ricercatori, con l’impiego dei plasmidi specializzati alla codifica di ogni subunità, hanno vagliato differenti combinazioni e concentrazioni delle componenti tossiniche. I dati sono in autoradiografia e misurazioni di scintillazione liquida. La combinazione dei plasmidi in rapporto molare 10:10:1 ha, comunque, confermato l’attività dell’enterotossina batterica. Il rapporto 1:1:1 si è rivelato, invece, privo di funzionalità. Identici risultati, escludenti le variazioni di concentrazioni, si sono registrati per valori molari doppi. Nessuna attività emolitica, dunque, per queste prove tossiniche.

Di autoradiografia in autoradiografia, sono emerse bande proteiche definite. Queste hanno dimostrato come l’attività emolitica cercata, in una sintesi in vitro di fatto molto vantaggiosa, richieda sempre un eccesso delle subunità NheA ed NheB, rispetto alla NheC. E’ stato, quindi, approfondito il ruolo di quest’ultima componente peptidica. I ricercatori sono giunti ad accertare che essa possa essere incrementata per un massimo di rapporto molare pari a 2. Il tutto in reazioni di sintesi accoppiate e cell-free. Da buon sistema aperto, le sintesi proteiche cell-free CFPS consentono, infatti, l’aggiunta di supplementazioni di componenti nella miscela di reazione.

I vantaggi dello screening rapido di un’enterotossina batterica

Di solito i ceppi batterici differiscono estremamente per resistenza e mutazioni. Le variazioni nella sequenza delle enterotossine prodotte da differenti ceppi batterici difficilmente vengono individuate in tempi brevi. Grazie a questo nuovo approccio analitico sperimentale, appena validato, un elevato numero di mutanti potranno essere studiati contemporaneamente, a tutto vantaggio della tempestività diagnostica e della nostra sicurezza.

Riferimenti bibliografici

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