La creazione dei farmaci del futuro passa dallo studio della Leucotossina LktA

Mannheimia haemolytica, l’agente che causa pasteurellosi polmonare

Mannheimia (precedentemente Pasteurella) haemolytica è un batterio anaerobico facoltativo Gram-negativo della famiglia delle Pasteurellaceae, appartenente alla classe dei Gamma proteobatteri.

Mannheimia haemolytica colorazione gram
Figura 1 – Colorazione di Gram di Mannheimia haemolytica

Questo batterio patogeno è responsabile della morte di bovini e ovini durante il loro trasporto, causando un’importante perdita economica che può arrivare anche a superare il milione di dollari americani ogni anno. Il batterio causa infezioni letali nel tratto respiratorio dei ruminanti, note come pasteurellosi polmonare o febbre da trasporto. Molti ceppi di M. haemolytica sono caratterizzati dalla presenza di fattori di patogenicità, ma è abbastanza chiaro che lipopolisaccaridi (LPS) e leucotossine (LktA) ne rappresentano la maggioranza ed anche la capsula può avere un ruolo nella patogenesi. 

pasteurellosi
Figura 2 – Pasteurellosi nel coniglio

La leucotossina LktA

Le citolisine, di cui fa parte la leucotossina LktA, appartengono alla sempre più numerosa famiglia delle tossine RTX (Repeats in ToXins – Ripetizioni in tossina) comprendente più di 1000 specie che mostrano varie e specifiche attività biologiche. È tipica nelle tossine RTX una catena di amminoacidi idrofilici al C-terminale lunga la metà della proteina. Questo dominio contiene un numero variabile di ripetizioni nonapeptidiche, ricche in glicina e contenenti aspartato, della sequenza consenso G-G-X-G-(N/D)-D-X-(L/I/F)-X, dove X può essere qualsiasi amminoacido.

Il dominio ripetuto della LktA, come quello delle altre tossine RTX, lega il calcio grazie al quale si ripiega in un motivo a β-rolls (rotoli β).

LktA è una proteina di circa 105 Kda codificata dal gene lktA che è parte di un operone comprendente altre 3 ORFs (Open Reading Frames – Griglie di lettura aperta) in ordine trascrizionale lktCABD. LktC è una lisina-aciltransferasi, enzima necessario per l’attivazione post-traduzionale della protossina LktA da parte dell’organismo; LktB e LktD sono necessarie per la secrezione della tossina, esse formano, con un canale omologo a TolC nella membrana esterna di M. haemolytica, un sistema di esporto di tipo 1 che funziona grazie all’idrolisi del ATP; LktB, che è un membro della superfamiglia delle proteine trasportatici ABC (ATP-Binding Cassette – Proteine a cassetta leganti ATP), si occupa di ricavare l’energia necessaria per far funzionare questo sistema.

La proteina di fusione di membrana LktD provvede al contatto tra il canale omologo a TolC nella membrana esterna e LktB nella membrana interna ed è parte essenziale del sistema di esporto di tipo 1. Il peptide segnale per l’esporto di LktA è presente al C-Terminale come nelle altre tossine RTX e comprende circa 50 amminoacidi.

Lkta sembra essere specifica per le cellule linfocitiche dei ruminanti. La presenza di recettori esposti sulla superfice cellulare dei macrofagi alveolari, quali l’integrina bovina beta2 LFA-1, è importante per l’interazione della tossina con la cellula bersaglio, la quale è calcio-dipendente. A basse concentrazioni, ad esempio sublitiche, LktA induce le cellule bovine a subire un burst (scoppio) respiratorio ed agisce come un fattore di virulenza innescando il rilascio di fattori infiammatori e produzione di citochine. Ad alte concentrazioni, ad esempio litiche, LktA induce ovviamente la formazione di pori nella membrana dei macrofagi che può portare ad apoptosi e/o a lisi cellulare.

La formazione di canali da parte della LktA porta alla dissipazione del gradiente ionico attraverso la membrana citoplasmatica, il che innesca lisi dei globuli rossi come processi apoptotici nei globuli bianchi. Anche la formazione di un ristretto numero di pori potrebbe essere sufficiente per innescare i processi di infiammazione della malattia, come scoppio respiratorio, il rilascio di fattori medianti l’infiammazione e la produzione di citochine da parte delle cellule bersaglio.

Nei linfociti B immersi in soluzione ipertonica, la leucotossina LktA provoca un incremento delle dimensioni che può essere inibito se nel mezzo è presente saccarosio 75 mM ma non mannosio. Questo suggerisce che il diametro dei canali formati dalla LktA è di circa 0,9 nm perché il raggio del saccarosio è vicino ai 0,5 nm.

Nello studio di riferimento si è investigata la formazione dei canali da parte della LktA nelle membrane lipidiche artificiali formate da difitanoil fosfatidilcolina in n-decano utilizzando metodi elettrofisiologici. 

Black lipid bilayer

Il metodo del black lipid bilayer (membrana lipidica nera) permette di generare una membrana artificiale in vitro. La camera che contiene la membrana è formata di Teflon ed è divisa in 2 compartimenti i quali sono in contatto tramite un foro la cui superfice è 0,4 mm. Le 2 camere vengono riempite di soluzione salina tamponata, prevalentemente a base di KCl poiché i 2 ioni, una volta dissociati, hanno stessa dimensione ma carica opposta quindi la stessa mobilità all’interno di un campo elettrico; su questo foro viene spennellata la soluzione di lipidi in n-decano e lo stato della membrana viene controllato mediante un oblò che ne permette l’osservazione.

Appena spennellata la membrana appare iridescente perché è piena di solvente, ma applicando un voltaggio tra le 2 camere essa si restringe e cambia colore; quando la membrana diventa nera si considera come un doppio strato fosfolipidico ed in quanto tale può interagire con proteine di membrana, presenti in soluzione stabilizzate da micelle, che vi si possono ricostituire. Tutto questo apparato è contenuto nella gabbia di Faraday per schermare la camera da eventuali cariche elettrostatiche esterne quindi per minimizzare il rumore di fondo.

Quando una porina si ricostituisce nella membrana artificiale polarizzata da una differenza di potenziale, si può osservare un incremento di corrente a gradino, letto da un amplificatore e monitorato da un registratore a nastro di carta.

Si può analizzare l’attività delle porine a diverse concentrazioni di KCl per monitorarne il comportamento di queste a differenti forze ioniche. Per avere un’analisi qualitativa della selettività del canale, si può sostituire il catione potassio con quello litio o l’anione cloro con quello acetato ed analizzare eventuali differenze nei valori di conduttanza a parità di concentrazione con la soluzione di riferimento (1M KCl).

L’equazione di Goldman-Hodgkin-Katz

Per avere un’analisi quantitativa sulla selettività del canale, si ricostituiscono decine di proteine sulla membrana artificiale in un mezzo a bassa forza ionica, dopo di che si cambia la concentrazione del soluto in una camera e si smette di applicare il voltaggio, la membrana rimarrà polarizzata per la differenza di mobilità dei 2 ioni ed il potenziale di questa si misura con un rivelatore ed interpreta tramite l’equazione di Goldman-Hodgkin-Katz per calcolare la razione di permeabilità tra il catione e l’anione:

equazione di Goldman-Hodgkin-Katz

Nell’equazione di Goldman-Hodgkin-Katz, R è la costante dei gas 8.3144 J K−1 mol−1; T è la temperatura espressa in gradi Kelvin; F è la costante di Faraday 96485 C mol-1; Pc e Pa sono le permeabilità di catione ed anione; ψ’ e ψ” sono il potenziale delle 2 camere e Vm è il potenziale della membrana.

Le sperimentazioni della LktA sulla membrana artificiale hanno mostrato come questa leucotossina abbia una conduttanza di riferimento, misurata in KCl 1 M tamponato a pH 6, di 200 pS (Siemens), il che la rende una delle più piccole tossine RTX studiate fino ad oggi.

L’analisi di questa leucotossina in presenza di differenti forze ioniche mostra un comportamento pressoché lineare ma non crescente con lo stesso rapporto della quantità di elettrolita presente in soluzione, infatti, quando la concentrazione di KCl triplica, la conduttanza all’incirca raddoppia. 

ElettrolitaConcentrazione (M)G (pS)
KCl0,0330 ± 6

0,1057 ± 9

0,1575 ± 11

0,30100 ± 12

1,00200 ± 20

3,00360 ± 25
LiCl1,0085 ± 11
KCH3COO (pH 7)1,00180 ± 18

Tabella 1 – Confronto dei dati di conduttanza della LktA in presenza di differenti soluti. In alto sono descritti i valori che riguardano solo KCl misurati a varie concentrazioni. In basso è riportata l’analisi qualitativa sulla selettività della leucotossina, ottenuta sostituendo in 2 esperimenti ognuno degli ioni del sale di riferimento.

Sostituendo il catione potassio con quello litio si ottiene un valore medio di conduttanza che si discosta molto di più da quello di riferimento, rispetto a quello dove si invertono l’anione cloro con quello acetato; valore che comunque varia debolmente poiché, evidentemente, il canale non è puramente selettivo per i cationi. La misurazione quantitativa dei valori di permeabilità, ottenuta come precedentemente descritto, mostra infatti una leggera selettività cationica di 5:1.

ElettrolitaRapporto delle permeabilità Pc/PaVm (mV)
KCl5,031,0 ± 2,4
LiCl4,629,8 ± 1,8
KCH3COO (pH 7)7,338,1 ± 2,3

Tabella 2 – Analisi quantitativa del potenziale di membrana misurato in presenza di 3 diversi elettroliti. In ogni esperimento il gradiente salino presente nelle 2 camere varia di un fattore 5: C’ = 0,1 M, C’’ = 05 M.

Studi di questo tipo possono essere eseguiti sulla maggioranza delle proteine formanti un poro che si inseriscono nella membrana artificiale. L’analisi della conduttanza fornisce numerose informazioni sulla mobilità ionica che attraversa il canale e, quindi, sulla natura dei soluti che vi possono passare, soluti che possono essere ad esempio medicinali o antibiotici.

Questi composti possono essere titolati nelle camere in concentrazione mM o μM e possono bloccare parte della corrente che attraversa i tanti canali ricostituiti. Dati così ottenuti possono essere interpretati con una cinetica del tipo Michaelis-Menten ottenendo un’analisi quantitativa sulla specificità di queste molecole per le proteine ricostituite.

Applicazioni future dello studio

Studi come questo rappresentano la base per la creazione di nuove molecole che saranno in grado di mirare le cellule bersaglio più opportune, massimizzandone l’assorbimento e minimizzando eventuali effetti collaterali nel resto dell’organismo e l’insieme di questi dati può dare inizio allo sviluppo di una nuova generazione di medicinali del futuro.

Articolo scritto da : Claudio Piselli – c.piselli@jacobs-university.de

Fonte originale curata da : Prof. Roland Benz – r.benz@jacobs-university.de

Finale revisione: Simone Giorginisimone.giorgini@gmail.com 

Bibliografia

  • Benz, R., Piselli, C., & Potter, A. (2019). Channel Formation by LktA of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica in Lipid Bilayer Membranes and Comparison of Channel Properties with Other RTX-Cytolysins. Toxins (Basel), 604.
  • Benz, R., Schmidt, A., & Vos-Scheperkeuter, G. (1987). Mechanism of Sugar Transport through the Sugar-Specific LamB Channel of Escherichia coli Outer Membrane. The Journal of Membrane Biology, 21-29.
  • Shlyonsky, V., Dupuis, F., & Gall, D. (2014). The OpenPicoAmp: an open-source planar lipid bilayer amplifier for hands-on learning of neuroscience. PLoS One, 9(9), e108097.

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