Lieviti umanizzati: strumenti utili per conoscere meglio l’uomo e curarlo

Ci risiamo: leggendo “lieviti umanizzati” qualcuno potrebbe storcere il naso o gridare al complotto fantascientifico, mentre si tratta invece di solida realtà scientifica.

I lieviti umanizzati sono infatti un potente strumento che ci ha già permesso (e continuerà a farlo) di conoscere meglio molti meccanismi cellulari umani, studiare le funzioni di molte proteine dell’uomo e mettere a punto strategie terapeutiche per varie malattie genetiche.

Vale la pena allora conoscerli meglio e capire in cosa consistono questi fantomatici “lieviti umanizzati”.

Cos’è un lievito umanizzato

Per “umanizzazione” di un lievito si intende la sostituzione di uno o più geni propri del lievito (si utilizza in genere l’organismo modello Saccharomyces cerevisiae – Figura 1) con il rispettivo gene ortologo umano, allo scopo di studiarne la funzione e la regolazione dell’espressione.

Saccharomyces cerevisiae
Figura 1 – Saccharomyces cerevisiae

Sembra incredibile, ma questo è reso possibile oltre che dalla capacità dei sistemi di trascrizione e traduzione di S. cerevisiae di riconoscere ed esprimere anche i geni umani, con le dovute accortezze di cui parleremo più avanti. Ma è permesso anche dal fatto che i genomi dell’uomo e di S. cerevisiae condividono il 23% di omologia.
Sebbene infatti i due genomi si siano evoluti separatamente a partire da un ancestore comune a partire da circa 1 miliardo di anni fa, molti geni sono stati conservati nelle due specie. Secondo Sonnhammer e Koonin (2002) sono ben 2300 i geni conservati. Considerando che l’intero genoma di S. cerevisiae contiene 6000 geni, 2300 di essi costituiscono una parte decisamente cospicua. Questi geni vengono definiti “ortologhi”: derivano da un ancestore comune, mantengono la stessa funzione e simili meccanismi di regolazione ma si trovano in organismi diversi.

Questa caratteristica, unita alla semplicità di manipolazione del genoma di S. cerevisiae, all’ampio sviluppo delle tecnologie del DNA e delle tecniche di sequenziamento, ha permesso l’affermarsi dei lieviti umanizzati come validi organismi modello per lo studio della biologia umana. Con alcuni limiti, ovviamente (una cellula di lievito è pur sempre minuscola e meno complessa dell’organismo umano). Ma con il grande vantaggio di poter avere informazioni immediate su proteine, sequenze geniche e sull’efficienza di potenziali farmaci per malattie genetiche. Vediamo come!

Come si umanizza un lievito

Innanzitutto, cerchiamo di capire come si umanizza un lievito.

Come già detto, lo scopo è quello di rimpiazzare i geni del lievito con i rispettivi geni umani. Con i recenti sviluppi delle tecnologie del DNA, i ricercatori hanno a disposizione una vasta gamma di tecniche per rimuovere porzioni di DNA e/o sostituirle inserendo le sequenze desiderate. Nel complesso esse si definiscono tecniche di genome editing.

Tra le tante, le più recenti nonché più efficienti sono le tecniche che si basano sull’utilizzo di nucleasi (enzimi che tagliano il DNA) ingegnerizzate per riconoscere siti specifici che si desidera modificare, in modo da “tagliare e cucire” a colpo sicuro. La tecnica di editing genomico CRISPR/Cas9 (Figura 2), ormai applicata in tantissimi campi, è una di queste.

tecnica di CRIPR-Cas9
Figura 2 – Schema riassuntivo della tecnica di CRIPR-Cas9

Se non ne avete sentito parlare, leggete qui. Oppure guardate questo video estratto dal ciclo di Webinar “La Microbiologia a 360°” realizzato da Microbiologia Italia in collaborazione con l’Università degli Studi di Palermo.

Strategie di umanizzazione di S. cerevisiae

Nel sostituire i geni del lievito, bisogna però tenere in considerazione che i sistemi di espressione di S. cerevisiae, sono evoluti separatamente e possono presentare delle caratteristiche e dei meccanismi regolatori diversi rispetto a quelli umani.

Ad esempio, l’apparato di splicing, seppur molto conservato e simile a quello umano, presenta delle limitazioni come l’incapacità di riconoscere introni particolarmente lunghi. Nei lieviti gli introni non superano lunghezze pari a 256 bp, mentre nel genoma umano troviamo introni fino a 3300 bp. Per ovviare a questo problema, i geni umani si possono inserire nel genoma del lievito sotto forma di cDNA. Si inserisce cioè direttamente la sequenza di DNA codificante, priva delle parti non trascritte/tradotte, in modo da facilitare il lavoro del lievito.

Inoltre, per studiare più facilmente la funzione del gene umano di interesse, una strategia utile che si utilizza è quella di rendere inizialmente deficitario il lievito. Lo si priva cioè di funzioni essenziali che possono essere osservate e misurate a livello fenotipico. Se il gene umano inserito successivamente è in grado di ripristinare il fenotipo, ovvero di “complementare” la funzione di quello precedentemente rimosso, allora vorrà dire che quel gene ha una funzione simile o comparabile.

Lo studio di Marcott sui geni essenziali

Usando questo principio, il gruppo di ricerca dell’Università del Texas guidato da Edward Marcott ha realizzato nel 2015 un grande studio sui geni essenziali di S. cerevisiae e sulla capacità di complementazione dei rispettivi geni umani, per studiare la conservazione della loro funzione durante l’evoluzione.

Nello specifico, i ricercatori hanno sostituito uno ad uno 414 geni di S. cerevisiae, responsabili di processi metabolici essenziali (sintesi di steroli, replicazione del DNA, ecc), con i rispettivi geni ortologhi umani. Il risultato? Di questi, circa la metà (il 47%) sono risultati essere efficacemente rimpiazzabili dai geni umani. Questo a conferma del fatto che nonostante l’evoluzione comporti divergenze, le funzioni essenziali vengono conservate tra specie diverse.

Inoltre, il loro studio evidenzia che i geni sono rimpiazzabili o non rimpiazzabili per moduli. I geni coinvolti nello stesso pathway (ad esempio la sintesi del colesterolo) sono tutti rimpiazzabili allo stesso modo, mentre nessun gene responsabile dell’inizio della replicazione del DNA può essere sostituito dal rispettivo umano. Questo conferma che le funzioni ancestrali critiche di alcuni geni vengono conservate in maniera pathway-dipendente, a prescindere dalla divergenza evolutiva a livello di sequenza.

Le applicazioni

Dalle più semplici alle più complesse, le applicazioni della tecnica di umanizzazione dei lieviti variano a seconda del “grado di umanizzazione”, ovvero di quali e quanti geni si decide di sostituire. Sono principalmente:

  • lo studio della funzione di geni umani che, una volta espressi, ristabiliscono un fenotipo oggetto di screening;
  • la creazione di lieviti umanizzati modelli di malattie genetiche o metaboliche, esprimendo quei geni specifici responsabili della patologia. Si possono usare questi modelli come piattaforme per lo studio di potenziali farmaci che interagiscono con quei geni impedendo il manifestarsi della malattia;
  • umanizzare interi pathway metabolici, trasferendo interi gruppi di geni nel genoma di S. cerevisiae. Questo permette di studiare la funzione delle singole proteine in un contesto più complesso e sicuramente più simile a quello di origine, ovvero quello umano. In questo modo si possono anche testare varie molecole per la loro capacità di interferire con il pathway stesso.

Recentemente, molti gruppi di ricerca hanno iniziato ad umanizzare i lieviti con geni non ortologhi. I sistemi di espressione di S. cerevisiae riescono comunque a riconoscerli grazie ad alcuni accorgimenti nella fase di genome editing. Ad esempio si possono utilizzare sequenze specifiche riconosciute dalle polimerasi, si possono assemblare i soli introni, ecc.

Esempi

Esempi di successo di umanizzazione dei lieviti sono:

  • la creazione di un modello di S. cerevisiae del morbo di Parkinson (Figura 3): un lievito che esprime il gene dell’α-sinucleina, la proteina responsabile della formazione di aggregati a livello pre-sinaptico che contribuiscono al progressivo sviluppo della malattia. La creazione di questo modello di lievito ha permesso di comprendere, ad esempio, che l’α-sinucleina è in grado di indurre degradazione proteica, autofagia e apoptosi nelle cellule.
modello di parkinson in s. cerevisiae
Figura 3- Modello di Parkinson in S. cerevisiae (Menezes et al., 2015)
  • l’umanizzazione di un ceppo di S. cerevisiae che mima la SLA, overesprimendo i geni TDP-43, FUS e OPTN responsabili della formazione delle placche amiloidi tipiche di questa patologia (Sun et al., 2011)

Conclusioni

Ad ogni modo, dai primi esperimenti di umanizzazione dei lieviti degli anni ’90, ad oggi i ricercatori hanno notevolmente implementato la tecnica. In particolare, nell’ambito dello screening di farmaci contro le malattie genetiche essa presenta le maggiori potenzialità.
Anche perché la conoscenza del DNA umano è giunta ad elevati livelli, tanto da avere a disposizione praticamente tutte le ORFs del DNA umano. Possiamo quindi potenzialmente creare modelli di S. cerevisiae per tantissime malattie e, perché no, riuscire a trovare anche il farmaco giusto mediante screening high-throughput veloci ed efficaci.

Bibliografia

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  • Menezes et al. (2015) From the baker to the bedside: yeast models of Parkinson’s disease Microbial cell, 2 (8) 262-279
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