CRISPR-Cas9: Taglia ed incolla interi genomi Batterici

Cos’è il gene editing con CRISPR-Cas9

Nell’ultimo decennio la Biologia Molecolare è stata protagonista di una grande rivoluzione scientifica chiamata CRISPR-Cas9; raffinata tecnica di gene editing messa a punto nel 2012 da Jennifer Doudna e dalla Dott.ssa Emmanuelle Charpentier con il supporto di altri ricercatori.

Il sistema CRISPR/Cas9 sfrutta i meccanismi scoperti negli anni ’90, tramite i quali i batteri si difendono da un’infezione virale.

Il processo di editing genomico verte su un enzima chiamato Cas9, una endonucleasi, proteina in grado di introdurre tagli all’interno della doppia elica del DNA.

La proteina Cas9 si associa a corte sequenze di RNA, in modo tale da appaiarsi al DNA complementare, procurando un taglio. Il processo non è casuale, ma viene indirizzato in posizioni estremamente specifiche. In laboratorio, la sequenza di RNA chiamata “guida” o sgRNA, che si assocerà a Cas9, viene deliberatamente scelta in maniera tale da guidare l’enzima nel punto esatto dove si vuole effettuare l’editing genomico.

In pratica, Cas9 può essere diretta verso una qualunque sequenza del DNA: animale, vegetale e batterica che sia, purché questa contenga alcune basi “d’ancoraggio” all’enzima e che terminino con una sequenza precisa chiamata PAM (Protospacer Adjacent Motif).

L’attività dell’enzima è sufficiente ad introdurre in una posizione specifica mutazioni casuali, ma se l’obiettivo è l’inserimento di una mutazione mirata devono essere fornite sequenze esogene di DNA adeguate ai cambiamenti che si vogliono effettuare.

A questo punto, sfruttando un sistema di riparazione del DNA chiamato “ricombinazione omologa”, la cellula provvederà ad autoriparare la rottura utilizzando il DNA esogeno, completando così l’editing.

In questo modo, sarebbe eventualmente possibile ottenere la correzione di mutazioni patologiche nel DNA o l’introduzione di varianti geniche che sono conosciute per essere importanti nella prevenzione di alcune malattie.

Facile da intuire il fatto che CRISPR-Cas9 sia strumento per una moltitudine di applicazioni biotecnologiche o biologiche in senso lato, che possono spaziare dalla ricerca sul cancro o sulle malattie genetiche (rare o non) alla creazione di nuove cultivar vegetali.

C’è un ma…

Il problema maggiore da affrontare, in particolare nelle applicazioni su cellule di origine umana, è la possibilità che Cas9 riconosca sequenze diverse da quella bersaglio e quindi introduca dei cambiamenti non voluti né predetti.

Infatti, il frammento di RNA che guida Cas9 ammette alcuni appaiamenti scorretti, rendendo Cas9 in grado di tagliare anche regioni del DNA diverse dal bersaglio.

Questa possibilità è oggetto di intensa ricerca, la sequenza ad esempio potrebbe essere ridotta di molto, identificando RNA guida molto selettivi e/o sfruttando Cas9 alternative o modificate che permettano una maggiore specificità, come quella messa a punto dal gruppo italiano del CIBIO di Trento guidato da Anna Cereseto.

Inoltre, esiste anche la possibilità che il taglio introdotto da Cas9 venga riparato in maniera scorretta risultando non nella correzione di un difetto genetico, ma nell’introduzione di nuove mutazioni. Nonostante questa sia un’eventualità rara, deve naturalmente essere presa in considerazione.

Questo problema può essere superato, per le molte malattie genetiche associate a specifiche mutazioni che determinano la sostituzione di una sola base nella sequenza del DNA, dall’utilizzo di forme di Cas9 modificate che permettono di sostituire chirurgicamente singole basi senza bisogno di tagliare il DNA.

L’utilizzo di questo nuovo approccio CRISPR, tra le altre cose, permette la correzione efficiente dei difetti genetici anche in cellule che non proliferano più, come quelle che compongono i tessuti ormai differenziati (neuroni ad esempio) e nelle quali si ritiene che la ricombinazione omologa non sia un processo attivo.

Limiti per l’ingegnerizzazione batterica

Come si può immaginare ricerche per migliorare la tecnica CRISPR-Cas9 sono molteplici ed intense, in questo articolo si riporta una recente miglioria che riguarda i batteri.

Le tecniche tradizionali prevedono l’utilizzo di enzimi detti enzimi di restrizione che tagliano il genoma batterico in siti ben precisi favorendo così l’intromissione o rimozione di materiale genetico. Successivamente le estremità tagliate vengono “saldate” nuovamente facendo assumere al plasmide batterico una forma circolare.

Tali tecniche hanno due grossi limiti: il primo è correlato alla quantità di segmenti genetici e al numero di basi per segmento da introdurre che risulta limitato a pochi geni; il secondo sta nella capacità di saldare le estremità che può risultare imprecisa, apportando errori vari ed imprecisioni, che si perpetuano per tutti i futuri cicli riproduttivi.

**Un nuovo tool di gene editing a misura di batterio**

In un recente studio, un Team dell’Università della California ha adattato CRISPR all’ingegnerizzazione batterica favorendo così l’intromissione di lunghi tratti di DNA senza lasciare errori. Hanno poi modificato un altro ben noto enzima chiamato “lambda” in grado di legare le estremità del cromosoma ingegnerizzato in modo preciso; facendogli assumere all’intero genoma batterico una forma circolare.

Questo perché i filamenti circolari di DNA ricombinati sono protetti da endonucleasi o enzimi in grado di degradare il DNA, ma esclusivamente quello lineare e non circolare.

La tecnica può creare coppie circolari di cromosomi batterici senza errori dando la possibilità ai ricercatori di scambiare cromosomi tra specie batteriche senza temere eventuali errori, ed eventualmente inserendo qualunque segmento di DNA all’interno dell’originale genoma.

Prospettive per il futuro

Come vuole la dinamica scientifica, prima di poter avere dei risvolti pratici e magari industriali ci vorranno sicuramente anni, ma indubbiamente riuscire a trasferire porzioni enormi di geni da una specie batteria ad un’altra con pochi errori permette in produzioni quali quelle di anticorpi ed antibiotici, ad esempio, di fare notevoli passi in avanti riducendo così i costi produttivi e migliorando la qualità del prodotto.

Simone Giorgini