Neurospora crassa

Caratteristiche

Neurospora crassa (Fig. 1 e 2) è un fungo filamentoso non tossico appartenente al phylum Ascomycota, che cresce nelle regioni tropicali e subtropicali. È ricca di carotenoidi che conferiscono un brillante colore arancione alle colture, possiede due tipi di accoppiamento opposti chiamati tipo “A” e tipo “a”, e inoltre presenta due strutture sessuali distinte, maschile e femminile. La denominazione del genere deriva da una parola greca che significa “nervo spore”, per via delle striature peculiari sulle spore.

N. crassa raffigura la tipica muffa del pane, e la prima descrizione pubblicata relativa a questo micete riguarda una contaminazione di panetterie francesi nel 1843. Poiché è semplice da coltivare e compie il suo ciclo vitale in stato prevalentemente aploide, è assai impiegata come organismo modello, specialmente per l’analisi genetica; rimanendo aploide per gran parte del suo ciclo, i caratteri recessivi sono visibile nella prole. L’arrangiamento ordinato dei prodotti di meiosi delle ascospore agevola l’analisi della ricombinazione genetica. In un lavoro del 2003 pubblicato su Nature, James E. Galagan e collaboratori hanno eseguito il sequenziamento del genoma di Neurospora; esso è ordinato in sette cromosomi, è costituito approssimativamente da 40 megabasi (Mb) e contiene 10082 geni codificanti per proteine (più del doppio del lievito Schizosaccharomyces pombe e circa il 25% di meno rispetto alla Drosophila melanogaster).

Da questo studio è emerso che Neurospora dispone della più ampia gamma di meccanismi di difesa del genoma, incluso un processo unico ai funghi detto mutazione puntiforme indotta dalla ripetizione (RIP), che ha come bersaglio le sequenze di DNA ripetute, comprese le ripetizioni in tandem, le ripetizioni non connesse, e le grandi duplicazioni segmentali (blocchi di sequenze ripetute con omologia reciproca alta, 95-100%. Sono note anche come dupliconi o Low Copy Repeats). L’analisi genomica suggerisce che questo meccanismo ha un profondo impatto sull’evoluzione del genoma, rallentando la creazione di nuovi geni attraverso la duplicazione genomica; ciò ha come risultato un genoma con una percentuale insolitamente bassa di geni strettamente correlati.

La storia della Neurospora crassa

A proposito dell’utilizzo di N. crassa come organismo modello, non dobbiamo dimenticare che essa rappresenta uno dei protagonisti nella storia e nel progresso della biologia molecolare. Tra il 1928 e il 1953 scienziati come Frederick Griffith, Oswald Avery, Alfred Hershey, Martha Chase, Rosalind Franklin, James Watson e Francis Crick introdussero dei concetti che costituiscono un importante progresso verso la conoscenza della natura del gene. Tuttavia, in quel periodo il meccanismo mediante il quale i geni controllano le attività cellulari era ancora ignoto. Nello studio concernente la funzione dei geni entrarono in scena George Beadle ed Edward Tatum del California Institute of Technology; nel 1940 riproposero la teoria di Archibald Garrod (rimaste ignorata per decenni dopo la pubblicazione di “Errori congeniti del metabolismo” nel 1908) secondo cui i geni controllano gli enzimi, ed eseguirono esperimenti con la Neurospora, che riesce a crescere in un mezzo di coltura semplice, contenente una fonte di carbonio (come uno zucchero), sali inorganici e biotina (Fig. 2).

Dal momento che necessita di poche risorse per vivere, la Neurospora deve essere capace di sintetizzare i metaboliti indispensabili. Beadle e Tatum trattarono le spore della muffa con raggi X o radiazioni ultraviolette e studiarono le mutazioni che comportavano alle cellule il deficit di un dato enzima. Lasciarono crescere le spore irradiate in un terreno minimo, sprovvisto dei componenti essenziali prodotti da questo organismo, e in un terreno arricchito. I due scienziati notarono che i mutanti crescevano nel terreno arricchito ma non in quello minimo, così misero le cellule in un terreno minimo con aggiunta di vitamine e in uno contenente amminoacidi. Le spore creavano le colonie nel primo terreno ma non nel secondo, quindi la mutazione era connessa a un gene codificante per un enzima coinvolto nella sintesi di una determinata vitamina. A quel punto lo scopo seguente fu quello di identificare il gene mutante; i due testarono le cellule irradiate su diversi terreni, ognuno arricchito con una specifica vitamina, e osservarono che la crescita della muffa avveniva esclusivamente sul terreno con acido pantotenico (vitamina B5). Da questi risultati, i ricercatori conclusero che la mutazione indotta annullava la via biosintetica di questo composto (il gene coinvolto in questa via è pan-2). Beadle e Tatum produssero diversi mutanti, ognuno deficitario nella via biosintetica di una particolare vitamina (uno aveva bisogno della tiamina per crescere, un altro della piridossina); grazie agli studi sui mutanti, Beadle e Tatum chiarirono la relazione tra geni ed enzimi, e nel 1958 ottennero il Premio Nobel per la medicina.

Filogenesi

Dominio             Eukaryota

Regno                 Fungi

Phylum               Ascomycota

Subphylum        Pezizomycotina

Classe                 Sordariomycetes

Ordine                Sordariales

Famiglia             Sordariaceae

Genere               Neurospora

Specie                 N. crassa

Morfologia e riproduzione

N. crassa risponde alla privazione dei nutrienti e all’essiccamento attraverso la produzione di spore asessuate, i macroconidi (o semplicemente conidi), i quali nascono da strutture aeree differenziate chiamate conidiofori. Il processo di sviluppo dei conidiofori può essere diviso in eventi precoci, che consistono nella formazioni di catene di proconidi mediante gemmazione ripetuta all’apice dell’ifa, ed eventi tardivi, che si fondano sulla genesi dei setti tra i proconidi adiacenti e la successiva separazione in spore. La crescita del conidioforo si ferma dopo che gli eventi precoci sono completati.

Il micelio vegetativo di N. crassa (Fig. 3a) si presenta come una massa fusa e aggrovigliata di ife che cresce attraverso e sopra il substrato. Una volta che ha ricevuto i segnali appropriati dall’ambiente, le ife producono nuove diramazioni orientate lontano dal substrato. Queste ife aeree proliferano e si ramificano allo scopo di costituire la massa aerea. La conidiogenesi inizia quando alcune delle ramificazioni, destinati a diventare conidiofori, cambiano la loro modalità di crescita da elongazione ifale a gemmazione apicale ripetuta. La gemmazione si avvia circa due ore dopo l’induzione della conidiogenesi. I primi giri di gemmazione sono distintivi in quanto danno luogo a catene con giunzioni interconidiali aventi un diametro quasi uguale a quello dei proconidi (Fig. 3b). Questi “restringimenti minori” sono caratteristici delle parti più precoci della catena di proconidi e, perciò, sono chiamati catene di costrizione minori. A quattro ore dall’induzione della genesi dei conidi, tali catene costituiscono la maggior parte della massa aerea. Nel momento in cui le catene continuano a gemmare, le giunzioni interconidiali neoformate hanno un diametro più ridotto, e vengono chiamate catene di costrizione maggiori. Da questo punto in avanti, l’intera crescita procede attraverso la formazione delle catene di costrizione maggiori, che rappresentano l’intera popolazione delle catene di proconidi (Fig. 3c). Dunque, una tipica catena proconidiale consiste in un corto segmento di catene di costrizione minori, seguito da un segmento molto più lungo di catene di costrizione maggiori. Le catene proconidiali possono ramificarsi anche quando crescono gemmando più di una volta da un singolo proconidio.

Una proprietà riconoscibile delle catene di costrizione minori è la tendenza a ritornare alla crescita ifale. La figura 3d mostra una ifa aerea che ha iniziato la formazione della catena di costrizione minore e in seguito si ramifica; notiamo che il ramo posto più in alto ha ripristinato la crescita ifale. La crescita di una singola catena può fluttuare ripetutamente tra gemmazione con restringimento minore ed elongazione ifale. Nelle catene di costrizione maggiori, al contrario, non è stata mai osservata la riattivazione della crescita ifale.

La generazione dei setti nelle giunzioni interconidiali inizia 8-10 ore dopo l’induzione e, se osservate al microscopio elettronico a scansione, ricordano dei collari tra i proconidi adiacenti (Fig. 3e). Successivamente i setti si ispessiscono, si formano delle rughe e si verifica la separazione dei conidi adiacenti, i quali rimangono attaccati da “fibre” connettive (Fig. 3f). Entro sedici ore dall’induzione, la maggioranza dei conidi sono separati l’uno dall’altro (Fig. 3g).

La maggior parte dei conidi all’interno di una coltura nascono da gemmazioni apicali consecutive, come descritto sopra, e tale processo prende il nome di sviluppo oloblastico. Questi conidi sono indicati come blastoconidi (o blastospore). Tuttavia, un ristretto numero di elementi simili ai conidi sorgono in maniera diversa: durante o dopo la formazione dei setti nelle catene di proconidi, una serie di setti extra appaiono nella ifa madre che dà origine al conidioforo. La distanza tra i setti extra più vicini al conidioforo è circa 10 μm, rispetto alla distanza media tra i setti delle ife normali di circa 50 μm. Lo spazio tra i setti incrementa con l’aumentare della distanza dalla catena; i setti extra subiscono lo stesso ispessimento e la stessa separazione di quelli nel conidioforo, conducendo alla disarticolazione dei segmenti ifali la cui dimensione oscilla da 5 a 30 μm, in base alla distanza dal conidioforo. Questo aspetto è tipico dello sviluppo tallico-artrico, e questi segmenti ifali disarticolati sono chiamati artroconidi. Essi compaiono 10-12 ore dopo l’induzione e prevalgono nell’intera coltura nel giro di venti ore, costituendo l’1% della massa conidiale totale (Fig. 3h). Le artrospore si possono distinguere dalle blastospore (che sono rotonde o rettangolari) grazie alla loro forma cilindrica.

Oltre alla riproduzione asessuata, N. crassa si riproduce anche sessualmente (Fig. 4B). I corpi fruttiferi sessuali (periteci) si possono formare solamente quando due miceli con un tipo di accoppiamento dissimile si fondono. Come abbiamo già accennato all’inizio, N. crassa ha due tipi di accoppiamento, indicati come “A” e “a”. Entrambi, in risposta alla riduzione dell’azoto, danno origine a strutture riproduttive specializzate, i protoperiteci, che sono costituiti dall’ascogonio (la gametocisti femminile), il quale appare come un’ifa multicellulare avvolta a spirale e chiusa in un’aggregazione di ife simile a un nodo. Un sistema ramificato di ife più sottili, chiamato tricogino, si estende dall’estremità dell’ascogonio e si proietta nell’aria oltre le ife di rivestimento. Il ciclo sessuato incomincia quando una cellula (di solito un conidio) del tipo di accoppiamento opposto entra in contatto con una parte del tricogino. Questa unione può essere seguita dalla fusione cellulare che porta a uno o più nuclei dalla cellula responsabile della fecondazione, la quale migra nell’ascogonio. Dato che sia il tipo “A” che il tipo “a” hanno le medesime strutture sessuali, nessuno dei due deve essere considerato unicamente maschile o femminile. Tuttavia, il protoperitecio, che si comporta come un ricevente di entrambi i tipi, può essere descritto come la struttura femminile, e il conidio fertilizzante (l’anteridio) può essere visto come la parte maschile.

Dopo la fusione delle cellule, la successiva unione dei nuclei avviene più tardi. Il nucleo proveniente dalla cellula fecondante e il nucleo dell’ascogonio si associano e iniziano a dividersi in maniera sincrona. I prodotti della divisione dei due nuclei migrano in un cospicuo numero di ife dell’ascogonio, le quali cominciano a crescere al dire fuori di esso. Ognuna di queste ife si curva per formare un uncino alla sua estremità (detto crozier), e i nuclei aploidi “A” e “a” all’interno di esso si dividono simultaneamente. Dipoi si generano i setti, al fine di dividere l’uncino in tre cellule; la cellula centrale nella curva dell’uncino contiene un nucleo “A” e un nucleo “a”. Questa cellula binucleata inizia la genesi degli aschi (strutture cave pluricellulari in cui si formano le ascospore) ed è chiamata cellula “asco-iniziale”. In seguito le due cellule mononucleate su entrambi i lati della prima cellula formante l’asco si fondono e danno vita a una cellula binucleata che cresce per formare un’ulteriore crozier; questo produce la propria cellula asco-iniziale. Tale processo può essere ripetuto molteplici volte.

Conseguentemente alla formazione della cellula asco-iniziale, i nuclei “A” e “a” si uniscono e generano un zigote diploide (2N), che rappresenta l’unica cellula diploide nell’intero ciclo vitale di N. crassa (proprietà comune a tutti gli ascomiceti). Il nucleo dello zigote contiene 14 cromosomi, risultanti dai 7 cromosomi dei nuclei aploidi. Lo zigote va incontro a meiosi ripristinando lo stato aploide; si creano quindi due nuclei aploidi del tipo “A” e due nuclei aploidi del tipo “a”. Un’ulteriore divisione mitotica porta alla formazione di quattro nuclei “A” e quattro nuclei “a” in ogni asco.

Mentre si svolgono gli eventi descritti sopra, il rivestimenti ifale che ha avvolto l’ascogonio si sviluppa come il muro del peritecio, si impregna di melanina e si annerisce. Il peritecio maturo presenta una struttura a forma di fiaschetta. Un peritecio maturo può contenere fino a 300 aschi, e normalmente quando giunge a maturazione, le ascospore vengono rilasciate nell’aria piuttosto energicamente. Queste ascospore sono resistenti al calore e, in laboratorio, richiedono un riscaldamento a 60 °C per 30 minuti allo scopo di stimolare la germinazione.

Patogenesi

Malgrado N. crassa sia conosciuta come un fungo saprofita, appare comunemente sulla vegetazione bruciata o sugli alberi dopo gli incendi boschivi. È stato suggerito che il calore derivato dagli incendi stimoli la germinazione delle ascospore nel suolo e fornisca un ambiente sterile, contenente nutrienti, che induce la crescita. A causa della mancanza di evidenze sperimentali, la natura della simbiosi di N. crassa con le piante viventi rimane un enigma.

In un lavoro del 2014, pubblicato su Scientific Reports, è stata messa in evidenza l’associazione di N. crassa con il pino silvestre (Pinus sylvestris) (Fig. 5). Al fine di investigare lo stile di vita alternativo di questo micete, gli scienziati hanno eseguito l’inoculazione di pianticelle di pino silvestre con una sospensione di conidi, e hanno documentato le sequenze della colonizzazione in un periodo di cinque mesi mediante fluorescenza e microscopia confocale. La maggioranza delle pianticelle avevano un aspetto sano ed erano indistinguibili da quelle non inoculate. Tuttavia, un singolare evento sorprese i ricercatori, cioè le ife fungine esprimenti la proteina GFP (green fluorescent protein) erano visibili dall’interno delle pianticelle inoculate ma non da quelle non inoculate. Durante la crescita nelle cellule del pino, la N. crassa proliferava e sopravviveva per cinque mesi senza causare alcun sintomo patologico, facendo supporre il suo stile di vita endofitico.

La scoperta più straordinaria di questo progetto di ricerca fu che N. crassa era in grado di agire sia come endofita che come patogeno sul pino silvestre, quando la pianta ospite veniva fatta crescere sul terreno water agar o in ambienti controllati all’interno della serra. L’infezione con N. crassa provocava i tipici sintomi patologici, causando alla fine la morte delle pianticelle. Il tasso di mortalità raggiungeva l’83% a cinque settimane dopo l’inoculazione (Fig. 5a), mentre il fungo patogeno Heterobasidion annosum comportava un effetto simile nel giro di 3-4 settimane (tasso di mortalità del 96%) (Fig. 5b). Durante lo stadio iniziale dell’infezione, N. crassa germinava formando strutture simili agli ifopodi (rami ifali specializzati, composti da una o due cellule lobate, necessari per l’attaccamento e l’assimilazione del cibo), penetrava nei tessuti delle piante, e cresceva a livello intracellulare o intercellulare tra le cellule vicine (Fig. 5d). La proliferazione invasiva proseguiva dalle cellule delle radici corticali (Fig. 5d e 5e) fino alla zona centrale (Fig. 5f), e le strutture simili agli ifopodi si trovavano in quasi il 50% delle cellule delle radici infettate. Al termine dell’infezione, le ife di N. crassa potevano svilupparsi dagli stomi sullo stelo delle pianticelle di pino infettate, e formavano i conidiofori con i conidi. Queste osservazioni dimostrarono che N. crassa può completare il proprio ciclo vitale in simbiosi con il pino silvestre, e tra l’altro supportava l’ipotesi secondo cui la N. crassa presenta uno stile di vita patogenetico.

Aspetti genetici ed epigenetici

N. crassa si è rivelata essere un eccellente sistema per studiare il controllo e la funzione della metilazione del DNA. Diversi organismi modello eucarioti, come il nematode Caenorhabditis elegans, il lievito replicante per gemmazione Saccharomyces cerevisiae e il lievito replicante per scissione S. pombe mancano di metilazione individuabile del DNA, e descrizioni isolate riguardanti la metilazione del DNA in un altro organismo, la Drosophila melanogaster, rimangono controverse. S. pombe possiede vari macchinari epigenetici assenti in S. cerevisiae, ma comuni agli organismi più elevati, in particolare l’RNA interference e la metilazione della lisina 9 sull’istone 3 (H3K9me); le ricerche eseguite impiegando questo micete hanno fornito preziose informazioni sulla struttura e la funzione dell’eterocromatina.  

In organismo come i mammiferi, la metilazione del DNA è fondamentale per la vitalità, e ciò complica alcune analisi. Nel DNA di N. crassa l’1,5% delle citosine sono metilate, ma tale modifica è superflua. Anche se bisogna essere cauti quando si estrapola da un sistema a un altro, alcune proprietà della metilazione del DNA appaiono conservate. Per esempio, le DNA metiltransferasi (enzimi che metilano i residui di citosina), sia quelle provenienti dai procarioti che quelle derivate dagli eucarioti, mostrano una singolare omologia nei domini catalitici.

N. crassa sfoggia delle caratteristiche presenti negli eucarioti più evoluti ma assenti nei due lieviti sopra citati, compresa la metilazione del DNA e la trimetilazione della lisina 27 sull’istone 3 (H3K27me3). Questa ultima è indotta dalle proteine del gruppo Polycomb, che attivano l’espressione dei geni della proliferazione e inibiscono quelli del differenziamento. In aggiunta a ciò, nella muffa N. crassa esistono distinti meccanismi di silenziamento basati sull’RNA interference (RNAi) che agiscono sia nelle cellule mitotiche che nelle cellule meiotiche. Tra questi abbiamo:

• il “Quelling”, che agisce al livello post-trascrizionale, riconosce gli mRNA derivati da sequenze ripetute e li bersaglia per la degradazione attraverso un meccanismo che implica la formazione di un intermedio a doppio filamento (dsRNA);
• il silenziamento meiotico (noto anche come silenziamento meiotico da parte di DNA non accoppiato), che agisce specificatamente nelle cellule in meiosi in cui il DNA spaiato silenzia le sequenze di DNA omologhe ad esso. In questo meccanismo sono presenti due proteine (SAD-4 e SAD-5) importanti per la produzione delle piccole molecole di RNA associate al silenziamento meiotico (masiRNAs);
• RIP (repeat-induced point mutation), già descritto in breve all’inizio, che opera nel momento in cui i nuclei contenenti elementi ripetuti di DNA entrano nella fase sessuata del ciclo.

Questi tre meccanismi entrano in azione in differenti stadi del ciclo riproduttivo della N. crassa: sviluppo vegetativo (Quelling) e sviluppo sessuale (RIP e silenziamento meiotico) (Fig. 6).

In questa parte ci si vuole focalizzare sul RIP citando un paio di studi scientifici. Innanzitutto, questo meccanismo è stato osservato per la prima volta durante il ciclo sessuato di N. crassa. Nello stadio dicariote aploide che segue la fecondazione e precede la meiosi, RIP processa selettivamente le sequenze duplicate su entrambi i filamenti di DNA inducendo mutazioni a singolo nucleotide che convertono le coppie di basi guanina:citosina in adenina:timina. Ciò ha come conseguenza l’introduzione di mutazioni missenso o nonsenso.

La scoperta di RIP si attribuisce a Eric U. Selker, in un lavoro del 1990, come il risultato un’analisi dettagliata della progenie derivata da incroci di ceppi trasformanti di N. crassa. Egli notò che le sequenze duplicate, sia native che estranee, geneticamente collegate o non collegate, subivano numerose mutazioni di transizione polarizzate (da G:C a A:T) nei genomi aploidi delle cellule eterocarionti che si creano successivamente alla fecondazione. Nel momento in cui la stabilità di un gene veniva testata, quando esso era unico nel genoma o anche combinato con un omologo non collegato, il sistema RIP era associato alle sequenze ripetute, ma anche indotto dalle sequenze ripetute. In un singolo passaggio attraverso il ciclo sessuato, fino al 30% delle coppie G:C nelle sequenze duplicate potevano essere mutate. Sovente le sequenze alterate da RIP erano sottoposte a metilazione de novo, ed è probabile che tali mutazioni avvengano attraverso la deaminazione enzimatica delle 5-metilcitosine (5mC) o mediante la deaminazione delle citosine seguita dalla replicazione del DNA. Ciò era stato ipotizzato in parte perché la metilazione della citosina coinvolge una reazione intermedia che tende alla deaminazione spontanea, e ciò suggerisce che la presunta deaminazione da parte di RIP può essere catalizzata dalla DNA metiltransferasi (DMT) o da un enzima simile alla DMT.

In uno studio del 1995, Michael J. Singer, Ben A. Marcotte, ed Eric U. Selker investigarono la connessione tra la metilazione del DNA e le mutazioni indotte da RIP. Esaminarono la capacità di indurre la metilazione de novo di otto alleli del gene am (codificante per la glutammato deidrogenasi) generati da RIP. Gli esperimenti vennero eseguiti in due modi: 1) si contrassegnavano le sequenze che, dopo essere state trattate con l’agente demetilante (5-azacitidina), erano rimetilate; 2) si demarcavano le sequenze non metilate che subivano la metilazione de novo in seguito all’inserimento nelle cellule di N. crassa. Il risultato fu che gli alleli che presentavano da 84 a 158 mutazioni erano abbondantemente metilati, e nel momento in cui venivano reintrodotti nelle cellule vegetative di N. crassa, si verificava la metilazione de novo. Gli alleli contenenti da 45 a 56 mutazioni erano metilati nei ceppi originariamente isolati ma non subivano la rimetilazione a seguito della reintroduzione nelle cellule vegetative. Negli alleli con 8 e 21 mutazioni, invece, non c’era alcuna metilazione individuabile (Fig. 7). I ricercatori osservarono che nel DNA di N. crassa la metilazione avveniva in siti non simmetrici (eterogenea), e questo indicava che tale metilazione, pur essendo dipendente da quella preesistente, non rifletteva una metilazione di mantenimento (questa consiste nel copiare le modifiche epigenetiche dal filamento stampo al filamento neoformato durante la replicazione del DNA).

Nonostante l’epigenetica sia una branca recente della biologia molecolare, è inequivocabile che i funghi filamentosi come N. crassa continueranno ad essere sorgenti ricche di informazioni sui meccanismi epigenetici che operano in una vasta gamma di organismi eucarioti.

Fonti

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