Pichia pastoris

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Caratteristiche

Pichia pastoris (Figura 1), anche noto come Komagatella phaffi, è un lievito metilotrofo appartenente alla classe degli Ascomiceti. Rappresenta, tra i lieviti, una delle piattaforme più comunemente utilizzate per l’espressione e produzione di proteine ricombinanti grazie ad una serie di vantaggi che lo caratterizzano. I più importanti sono, senz’altro, il possesso di un sistema di espressione genica altamente regolato, un set di promotori forti e un metabolismo respiratorio fortemente favorito rispetto alla crescita fermentativa.

P. pastoris è ampiamente distribuito in natura; è comunemente presente nel suolo e sulla corteccia di alberi, specie il castagno.

Cellule di Pichia pastoris
Figura 1 – Cellule di P. pastoris (www.biotechresources.com)

Comunemente, P. pastoris si trova nello stato vegetativo aploide ma è in grado di effettuare una riproduzione sia sessuata che asessuata. Nel caso della riproduzione asessuata, le cellule di lievito si moltiplicano per gemmazione (Figura 2). La carenza di azoto può invece indurre fenomeni di mating (accoppiamento) tra cellule, portando alla formazione di cellule diploidi. Queste, se mantenute su terreno di crescita standard, proseguono con la crescita vegetativa permanendo nello stato diploide. Se la carenza di azoto, invece, si protrae, esse vanno incontro a meiosi e producono ascospore aploidi.

gemmazione di P. pastoris
Figura 2 – Cellula di P. pastoris in fase di gemmazione (immagine presa da www.invitrogen.com)

Il metabolismo metilotrofo

P. pastoris è una specie eterotrofa, in grado di utilizzare varie fonti di carbonio per la crescita (glucosio, glicerolo ecc.), tranne il lattosio. Come già anticipato, è un lievito metilotrofo, in grado cioè di consumare anche composti C1 derivanti dal metano, tra cui il metanolo, per la produzione di energia.

Nello specifico, P. pastoris è in grado di consumare la formaldeide derivante dal metabolismo del metanolo, mediante la via della serina (Figura 3). In questo pathway metabolico, la formaldeide viene dapprima convertita in metilene tetraidrofolato che reagendo con la glicina forma la serina. La serina, a sua volta, perde il gruppo amminico e diventa idrossipiruvato che viene poi ridotto a glicerato. Da qui si innesca una catena di reazioni che portano alla sintesi dell’acetil-CoA, destinato alle vie biosintetiche.

Via della serina nel metabolismo della formaldeide
Figura 3 – Via della serina nel metabolismo della formaldeide

Filogenesi

DominioEukaryota
RegnoFungi
PhylumAscomycota
ClasseSaccharomycetes
SottoclasseSaccharomycetidae
OrdineSaccharomycetales
FamigliaSaccharomycetaceae
GenerePichia
Speciepastoris

Morfologia delle colonie

Le cellule di P. pastoris hanno una dimensione che varia tra i 4-6 μm. Se coltivata su terreno comune YM a 25°C, forma delle colonie di piccole-medie dimensioni, lisce e con una colorazione che varia dal bianco al color crema. I margini delle colonie sono lisci (Figura 4).

Morfologia delle colonie di P. pastoris
Figura 4 – Morfologia delle colonie di P. pastoris (www.jcm.riken.jp)

Patogenesi

Nessun ceppo di P. pastoris è stato identificato come patogeno o tossico e nessuna patologia umana e animale gli è stata associata finora. E’ un microrganismo riconosciuto come GRAS (Generally Regarded As Safe) e approvato per la produzione di proteine ricombinanti destinate a vari usi (alimentare, farmaceutico, industriale).

Metodi di identificazione

Per l’identificazione di P. pastoris si utilizzano principalmente le tecniche di identificazione molecolare basate sull’amplificazione tramite PCR di specifici tratti di DNA e relativo sequenziamento.

Le sequenze solitamente amplificate sono:

  • le sequenze di unità ripetute di DNA ribosomale ITS1 e ITS2 (internal transcribed spacer)
  • il gene 5.8S.

Oltre al sequenziamento e successivo allineamento in banca dati, è possibile analizzare le sequenze amplificate mediante la tecnica rDNA PCR RFLP (restriction fragment length polymorphism). Essa consiste nell’amplificare regioni specifiche del DNA, come quelle menzionate in precedenza, e sottoporle a trattamento con enzimi di restrizione. Una corsa elettroforetica permetterà poi di individuare le dimensioni dei frammenti, che sono specie-specifiche, e consentono quindi di identificare le specie di interesse come P. pastoris in questo caso.

Le applicazioni industriali

P. pastoris è l’organismo modello (tra i lieviti) per la produzione di proteine ricombinanti a livello sperimentale e industriale vero e proprio. Data la semplicità di trasformazione e manipolazione genica di questo microrganismo, la facilità di coltivazione e le elevate rese, P. pastoris è già ampiamente utilizzato per produzioni su larga scala (Figura 5) di enzimi e proteine a scopo terapeutico e alimentare.

fermentazione di P. pastoris in bioreattore
Figura 5 – Fermentazione di P. pastoris in bioreattore e relativo grafico di espressione della proteina ricombinante

Fonti

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