Colorazione con arancio di acridina (microscopia a fluorescenza)

Obiettivo della tecnica

La colorazione con arancio di acridina è una tecnica utilizzata nella microscopia a fluorescenza per l’osservazione e l’identificazione di una vasta gamma di microrganismi diversi, sia in campioni non fissati che in colorazioni vitali.

Può essere applicata tanto ai batteri quanto ai funghi, ai lieviti ed ai protozoi: in ambito clinico è sfruttata in particolare (ma non solo) per la diagnosi delle vaginosi batteriche e fungine, oppure laddove si sospetti infezione da parte di Trichomonas vaginalis.

La colorazione con arancio di acridina è una metodica molto versatile, rapida e di facile realizzazione, per questo motivo può essere utilizzata nell’analisi di numerosi materiali di partenza differenti: strisci di sangue, strisci vaginali, sedimenti citologici umani (ad esempio urina oppure espettorati), nonchè molti altri ancora.

Una particolare menzione merita il suo impiego negli studi di fertilità, dove essa permette di stabilire il numero ed il grado di vitalità degli spermatozoi.

Ultimi ma non certo in ordine d’importanza, sono infine gli utilizzi di questa colorazione nelle analisi ambientali del suolo e dell’acqua (sia dolce che marina) finalizzate a stabilirne la carica batterica oppure l’identificazione dei microrganismi presenti.

Che cos’è e come funziona

La colorazione con arancio di acridina fu inventata nel 1942 dai medici tedeschi Hilbrich e Strugger.

L’unico colorante utilizzato da questa metodica è l’arancio di acridina: si tratta di una fluorocromo, cioè di una molecola che a causa della sua particolare struttura chimica, è capace di assorbire soltanto lunghezze d’onda corte della luce (luce laser) e riemettere poi l’energia assorbita in lunghezze d’onda maggiori (che risultano pertanto visibili all’occhio umano) (Fig.1).

struttura chimica e rappresentazione molecolare dell'arancio di acridina

Figura 1 – Senza voler entrare nel dettaglio del meccanismo fisico e molecolare, ci limiteremo in questa sede ad una spiegazione essenziale su come funziona il fluorocromo.
Gli anelli eterocicli aromatici dell’arancio di acridina sono strutture elettronicamente dense; esse vengono pertanto eccitate quando assorbono la luce laser, una luce cioè che contiene selettivamente soltanto alcune delle componenti normalmente presenti nello spettro e dotate di alta energia. Questa energia viene poi riemessa dalla molecola priva di parte del suo contenuto, sotto forma di lunghezze d’onda della luce più lunghe che vengono amplificate e direzionate all’oculare del microscopio da un sistemi di lenti tradizionali
.

L’arancio di acridina è un composto organico cellula permeabile, che s’intercala selettivamente agli acidi nucleici (da qui la versatilità del suo impiego per tipi cellulari e microrganismi diversi): esso tuttavia presenta un comportamento fluorescente diverso in base al fatto che si leghi al DNA o all’RNA (si parla infatti di “comportamento metacromatico” o differenziale).

Quando si lega al dsDNA, l’arancio di acridina presenta infatti un’eccitazione massima a 502 nm (ciano) e riemette con luce visibile verde (525 nm).

Diversamente, quando invece si lega all’RNA (oppure al ssDNA), la massima eccitazione si ha a 460 nm (nel blu) e l’emissione si ha a 650nm (nel rosso).

Tali differenze sono dovute allo specifico tipo d’interazioni elettrostatiche che il colorante instaura con ognuno dei due acidi nucleici, nonchè alla loro configurazione molecolare: in questa trattazione tuttavia non entreremo nel dettaglio di questi aspetti, esulando essi dallo scopo pratico prefissato.

In generale, il risultato finale sarà che le strutture cellulari particolarmente ricche in DNA (quali cromosomi, nuclei ed eventuali inclusioni virali) esibiranno una fluorescenza tra il giallo ed il verde, mentre quelle ricche in RNA (ribosomi, nucleoli, etc..) presenteranno invece una fluorescenza nel rosso.

Occorre però prestare attenzione all’effetto del pH, che è responsabile dell’inversione di colore del citosol dei microrganismi rispetto alle cellule umane e che permette di distinguerle quando si osserva un campione misto.

Le interazioni elettrostatiche tra l’arancio di acridina e gli acidi nucleici risente molto di parametri quali la forza ionica ed il pH: l’arancio di acridina infatti è un colorante basico cationico (carico positivamente).

La forma protonata del colorante, che è quelle prevalente a pH acido, emette intorno a 630 nm (nel rosso arancio), perchè in queste condizioni forma aggregati che precipitano nel citoplasma:dal momento il citoplasma batterico è più acido di quello umano, i batteri (ed in generale i microrganismi con citoplasma debolmente acido) tenderanno perciò ad assumere una colorazione citosolica quasi sempre tra il rosso ed il mattone.

Di contro la forma cationica dell’arancio di acridina, prevalente a pH citosolico umano (7,4-7,5) emette fluorescenza intorno a 530 nm (verde giallo) perchè le singole molecole non formano aggregati sterici ma si distanziano tra loro: il passaggio della luce laser nel campione seguirà perciò un cammino diverso, responsabile appunto della diversa fluorescenza.

Gli esempi che seguiranno quando tratteremo dell’osservazione del vetrino serviranno a chiarire meglio le idee ma in generale (fatto salvo pochissime eccezioni), unendo quando detto sinora sul comportamento dell’arancio acridina nei confronti degli acidi nucleici e del citoplasma, si può dire che:

  • le cellule umane (epiteliali, leucocitarie, etc..) si presenteranno sempre con un citoplasma fluorescente tra il giallo ed il verde, in cui il nucleo ben tondeggiante risalterà in verde acceso
  • le cellule dei microrganismi (batteri, funghi, lieviti, protozoi) avranno invece una tonalità di fluorescenza citosolica tra il rosso e l’arancio mattone: in essi, l’unica zona colorata in verde sarà ovviamente quella in cui si trova la maggior concentrazione di DNA (Fig.2)
striscio epiteliale colorato con arancio di acridina per microscopia a fluorescenza
Figura 2 – Esempio di un campione di striscio epiteliale umano osservato a basso ingrandimento (10x): si possono distinguere i differenti colori fluorescenti delle cellule umane (citosol verde giallo, nucleo verde acceso) e di quelle batteriche, più piccole, che appaiono invece di tonalità arancio mattone.

Materiale occorrente

  • Un vetrino per microscopio a fluorescenza
  • Un vetrino copri oggetti
  • Soluzione colorante arancio di acridina (in commercio ne esistono di vari tipi, tutti ugualmente validi), con contagocce
  • Soluzione fisiologica (0,85% p/v di cloruro di sodio)
  • Apposita soluzione decolorante per questo tipo di metodica (si tratta di una soluzione alcolica salina: può essere facilmente preparata mescolando semplicemente 5 ml di etanolo assoluto oppure metanolo, con 245 ml della soluzione fisiologica 0,85% p/v di cloruro di sodio)
  • Microscopio a fluorescenza

Procedimento

(ATTENZIONE- In quanto intercalante del DNA, l’arancio di acridina è classificato in letteratura come agente mutageno e potenzialmente tumorigenico: utilizzare pertanto la massima attenzione nel maneggiarlo! Esso inoltre può causare irritazioni alle vie respiratorie e agli occhi nei soggetti più sensibili. Si raccomanda pertanto di operare sotto cappa indossando guanti, mascherina ed occhiali da laboratorio)

  • Preparare uno striscio del campione da analizzare e lasciar asciugare il vetrino all’aria (attenzione: i campioni andranno però colorati entro 24 ore al massimo!)
  • Con l’ausilio di un contagocce, porre l’arancio di acridina sul campione e lasciar agire per circa 5-10 secondi
  • Effettuare un lavaggio con soluzione fisiologica per allontanare il colorante in eccesso
  • Decolorare lo striscio con l’apposita soluzione alcolica salina, trattandolo per 5-10 secondi
  • Effettuare nuovamente un lavaggio con fisiologica, quindi lasciar asciugare il vetrino all’aria
  • Aggiungere allo striscio una goccia di acqua distillata oppure di fisiologica, quindi coprire col vetrino porta oggetti.

(Si raccomanda di effettuare l’osservazione del vetrino entro e non oltre un massimo di 24 ore dalla colorazione, dal momento che la fluorescenza decade molto facilmente ed in tempi brevi!)

Osservazione del vetrino

L’osservazione del vetrino viene condotta al buio (come è sempre raccomandabile del resto quando si lavora in fluorescenza).

Si consiglia di utilizzare un filtro di eccitazione di tipo BG12, in combinazione con filtri di sbarramento N.44 e N.53 (caratterizzati cioè da lunghezze d’onda d’eccitazione a 470 nm e di emissione rispettivamente a 530 nm e 650 nm).

Uno dei vantaggi di questa metodica, è che essa permette di ottenere buoni risultati restando ad ingrandimenti tutto sommato bassi (intorno al 40x) rispetto a quanto invece richiesto da altre colorazioni, quale ad esempio quella di gram.

Si procede dapprima con l’obiettivo a 10x, al fine di esaminare la distribuzione del materiale fluorescente, poi si salirà gradatamente col livello d’ingrandimento, sino al 40x.

L’arancio di acridina permetterà di differenziare e distinguere sia i vari tipi cellulari presenti nel campione che le loro strutture interne, proprio grazie al suo comportamento metacromatico: le cellule ed i microrganismi appariranno colorati con diverse tonalità rilucenti, su uno sfondo completamente nero (Fig.3).

Trichomonas vaginalis osservato in microscopia a fluorescenza con arancio acridina
Figura 3 – In questo campione derivato da striscio vaginale, è riconoscibile la presenza di un trofozoita di Trichomonas vaginali dal citoplasma rosso mattone, il cui nucleo appare di forma tondeggiante color giallo verde. Le cellule intorno a lui, che mostrano invece fluorescenza citosolica giallo verde e nucleo verde acceso, sono cellule epiteliali umane

Come si diceva, la colorazione con arancio acridina può essere utilizzata anche per valutare il grado di contaminazione batterica di diversi tipi di matrici biologiche o ambientali (Fig.4)

Corynebacteria colorati con arancio di acridina
Figura 4 – E’ chiaramente visibile la forma a bastoncello di batteri del tipo Corynebacteria; la fluorescenza citosolica più tendente all’arancio che al rosso è dovuta in questo caso al particolare pH del citoplasma del microrganismo, secondo il principio enunciato in precedenza riguardo agli effetti di pH sull’arancio acridina

Anche all’interno delle cellule umane, oltre a quelle di particolari microrganismi riportati in letteratura, si possono avere tuttavia comportamenti insoliti: un esempio a tal proposito è quello delle cellule spermatiche (Fig.5)

spermatozoi colorati con arancio di acridina per microscopia a fluorescenza
Figura 5 – Negli spermatozoi, la testa ovviamente fluoresce in verde per la presenza del DNA. Tuttavia anche il flagello, unicamente di natura proteica, presenta inaspettatamente una colorazione e di tipo opposto. Ciò è dovuto alle particolari proteine cariche negativamente espresse sulla sua superficie, le quali legano strettamente l’arancio acridina creandone cosi’ aggregati che si distribuiscono su tutta l’area del flagello stesso

Si raccomanda perciò di consultare sempre con attenzione la letteratura scientifica, prima di procedere all’analisi di un campione ottenuto con la colorazione all’arancio di acridina.

Fonti

Sitografia di riferimento

Bibliografia di riferimento

Scheda tecnica dell’azienda Sigma Aldritch sull’arancio di acridina (N. 1.15931.0025)

Nicola Carlone, Raffaello Pompei. Microbiologia Farmaceutica. Napoli: edizioni Edises, 2013

Crediti per le immagini

Immagine in evidenza (e figura 2)

Figura 1:

Figura 3:

Figura 4:

Figura 5:

Informazioni su Simone Rinaldi 43 Articoli
Autore e amministratore di Microbiologia Italia. Laureando in Biotecnologie Farmaceutiche presso l'Università degli Studi di Milano con una tesi in Biocatalisi, precedentemente diplomato con maturità classica. Unisco l'amore per la scienza a quello per le discipline umanistiche: ho infatti molti interessi diversi, amo cucinare e sono un appassionato di romanzi e cinema, soprattutto per quel che riguarda il genere fantasy.

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