Colorazione Ematossilina-Eosina

Obiettivo della tecnica

La colorazione Ematossilina–Eosina (EE) è la più comune colorazione istologica, utilizzata prevalentemente in microscopia ottica ed applicabile con tutti i metodi fissativi, eccetto quelli che prevedono la presenza di osmio.

Cartilagine ialina in Ematossilina-Eosina
Figura 1 – Cartilagine ialina in Ematossilina-Eosina

Questo tipo di colorazione consente di osservare, in chiave prettamente morfologica, un particolare organo o tessuto di un organismo animale.

Inoltre, è la colorazione base in esami istopatologici di routine, necessari per identificare alterazioni patologiche a livello di un organo o di un tessuto.

Carcinoma bronchioalveolare in Ematossilina-Eosina
Figura 2 – Carcinoma bronchioalveolare, colorazione Ematossilina-Eosina

La colorazione Ematossilina–Eosina è definita combinata, o meglio bicromica, in quanto vi è la combinazione dei due coloranti più comuni in campo istologico: ematossilina (o emallume acido di Mayer) ed eosina.

L’utilizzo di due coloranti diversi tra loro consente di evidenziare differentemente i costituenti di una cellula, inoltre la colorazione dipende dal valore di pH delle diverse zone cellulari.

Che cosa sono l’ematossilina e l’eosina?

È fondamentale conoscere le principali caratteristiche dei due coloranti utilizzati in questa colorazione: l’emallume acido di Mayer e l’eosina.

  • L’emallume acido di Mayer si prepara sciogliendo in acqua distillata diverse componenti: ematossilina, allume di potassio, iodato di sodio, cloralio idrato ed acido acetico. La componente principale è l’ematossilina, di origine vegetale, in quanto estratta da Haematoxylon campechianum, una leguminosa presente in America del Sud. L’ematossilina non è il colorante vero e proprio, ma lo diventa per ossidazione ad emateina. L’emateina esercita un’attività tintoriale solo in presenza di un mordenzante (ponte tra tessuto e colorante); nella miscela dell’emallume acido di Mayer è l’allume di potassio. In base al mordenzante utilizzato, vi sono diversi tipi di ematossilina. L’ematossilina è un colorante basico, colora in blu/viola le componenti cariche negativamente (basofile), quali acidi nucleici, presenti a livello del nucleo.
Struttura chimica dell'ematossilina
Figura 3 – Struttura chimica dell’ematossilina
Ossidazione dell'ematossilina ad emateina (struttura chimica)
Figura 4 – Ossidazione dell’ematossilina ad emateina
  • L’eosina viene preparata all’1% in acqua leggermente acidificata; la sua composizione è la seguente: eosina 1%, Orange G 0,5% e acido acetico in gocce. L’eosina è un derivato della fluoresceina e si presenta sotto forma di polvere cristallina di colore rosso, solubile in acqua ed in alcool. Al contrario dell’ematossilina, l’eosina è un colorante acido, colora in rosso/rosa le componenti cariche positivamente (acidofile), quali proteine cellulari, presenti a livello citoplasmatico. L’eosina al 2% invece, è utilizzata come disinfettante della cute, in quanto favorisce la cicatrizzazione. Oltre all’eosina comune, ossia l’eosina Y, esiste anche l’eosina B, polvere cristallina bruna solubile in acqua. L’eosina B si differenzia da quella comune per la sua struttura chimica, in quanto vi è la presenza di due gruppi nitrici al posto di due dei quattro atomi di bromo.
Struttura chimica dell'eosina Y
Figura 5 – Struttura chimica dell’eosina Y
Struttura chimica dell'eosina B
Figura 6 – Struttura chimica dell’eosina B

Materiale occorrente

  • Vetrino porta oggetti con il preparato istologico da colorare;
  • Xilene;
  • Etanolo (100˚,95˚,70˚,50˚);
  • Vaschette per colorazioni istologiche (tipo Coplin, Hellendahl, Schiefferdecker);
  • Ematossilina;
  • Eosina;
  • Pinzette a punte piatte;
  • Vetrino copri oggetto;
  • Montante resinoso.
Vaschetta per colorazione istologica di tipo Coplin
Figura 7 – Vaschetta per colorazione istologica di tipo Coplin

Procedimento

Sparaffinatura ed idratazione

I vetrini con il preparato istologico sono immersi in:

  • Xilene, per eliminare la paraffina;
  • Etanolo a concentrazione sempre minore per consentire l’idratazione dato che i coloranti si utilizzano in soluzione acquosa (100˚,95˚,75˚,50˚);
  • Acqua distillata.

I passaggi in xilene ed etanolo hanno durata di diversi minuti.

Colorazione

I vetrini sparaffinati ed idratati sono immersi nelle soluzioni coloranti e sottoposti a diversi lavaggi:

  • Ematossilina (da 2 a 10 minuti);
  • Lavaggio in acqua di fonte (da 5 a 10 minuti) che, essendo leggermente alcalina, consente il viraggio di colore dei nuclei, da violaceo ad azzurrognolo.
  • Lavaggio in acqua distillata, per eliminare I residui di sale dell’acqua corrente;
  • Eosina (da 30 secondi ad 1 minuto);
  • Lavaggio in acqua distillata.

Disidratazione e chiusura

I vetrini colorati vengono disidratati e chiusi tramite i seguenti passaggi:

  • Etanolo a concentrazione sempre maggiore per consentire la disidratazione (50˚,75˚,95˚,100˚);
  • Xilene, sostanza miscibile con il montante resinoso;
  • Montante resinoso posto sulle sezioni;
  • Vetrino copri oggetto lasciato cadere sul montante resinoso;
  • Vetrino posto in stufa fino a completo indurimento.

I vetrini vengono solitamente maneggiati utilizzando delle pinzette a punte piatte.

Pinzette a punte piatte usate per maneggiare i vetrini
Figura 8 – Pinzette a punte piatte usate per maneggiare i vetrini
Video 1- Passaggi fondamentali da eseguire per la colorazione Ematossilina-Eosina

Osservazione del vetrino

I vetrini colorati vengono osservati al microscopio ottico utilizzando qualsiasi ingrandimento, ma quello preferenziale è l’ingrandimento massimo (100x), in quanto consente di evidenziare maggiori dettagli morfologici del preparato, rispetto ad ingrandimenti minori che consentono solo una visione generale del campione.

Non dimentichiamo che utilizzando gli obiettivi a più alta risoluzione (40x, 100x), è necessario l’uso degli oli per immersione.

È proprio grazie alla colorazione Ematossilina-Eosina che durante l’osservazione microscopica riusciamo a distinguere i diversi componenti cellulari:

  • i nuclei hanno un colore che varia dal blu scuro al viola scuro;
  • il citoplasma, le sostanze intercellulari e le fibre muscolari, hanno un colore che varia dal rosa al rosso;
  • I fluidi presenti nei tessuti, o negli spazi interstiziali, si colorano debolmente, identificandosi come ampi spazi bianchi (sangue, linfa, etc.);
  • Grassi e lipidi non si colorano.
Tessuto muscolare striato scheletrico, sezione longitudinale. In viola, i nuclei, disposti in periferia; in rosa acceso, le fibre muscolari disposte longitudinalmente
Figura 9 – Tessuto muscolare striato scheletrico, sezione longitudinale. In viola, i nuclei, disposti in periferia; in rosa acceso, le fibre muscolari disposte longitudinalmente
Tessuto connettivo irregolare denso. In viola, i nuclei; in rosa, la matrice composta da fibre di collagene
Figura 10 – Tessuto connettivo irregolare denso. In viola, i nuclei; in rosa, la matrice composta da fibre di collagene
Tessuto epiteliale pavimentoso pluristratificato cheratinizzato. In alto, al di sotto dello strato di cheratina superficiale, i nuclei, in viola; in basso, in rosa, la matrice connettivale
Figura 11 – Tessuto epiteliale pavimentoso pluristratificato cheratinizzato. In alto, al di sotto dello strato di cheratina superficiale, i nuclei, in viola; in basso, in rosa, la matrice connettivale
Tessuto adiposo. Privi di colore, gli adipociti; In periferia, in viola, i nuclei appiattiti
Figura 12 – Tessuto adiposo. Privi di colore, gli adipociti; In periferia, in viola, i nuclei appiattiti

Fonti

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