Colorazione Feulgen: identificare il DNA

Obiettivo della tecnica

La colorazione di Feulgen Γ¨ una tecnica di istologia utilizzata per evidenziare il DNA su sezioni di tessuto preparate per la microscopia ottica. In condizioni controllate, puΓ² essere utilizzata anche per determinare il contenuto di DNA in una preparazione mediante misura densitometrica.

La tecnica prende il nome dal fisiologo tedesco Robert Feulgen (Figura 1) che la mise a punto nel 1925.

Robert Feulgen
Figura 1 – Robert Feulgen (Benedum, J. and M. Meusch. β€œRobert Feulgen (1884–1955) – some biographical thoughts.” Histochemistry and Cell Biology 111 (1999): 337-343.)

Materiale occorrente

Per la colorazione di Feulgen si utilizza l’acido cloridrico e il reattivo di Schiff per colorare il DNA in rosso magenta, mentre non colora l’RNA: La metodica Γ¨ quindi utile per differenziare il DNA dall’RNA, che sono entrambi basofili.

L’acido cloridrico serve a separare dalla molecola di DNA le basi puriniche. Il deossiribosio libero, in ambiente acido, si trasforma in aldeide e i gruppi aldeidici sono evidenziabili con l’uso del reattivo di Schiff (Figura 2).

L’RNA, invece, non reagisce in quanto la presenza di un gruppo -OH sul carbonio 2 del ribosio impedisce l’idrolisi dello zucchero ad opera dell’acido cloridrico.

Reazione di Feulgen
Figura 2 – Meccanismo della reazione di Feulgen (https://docplayer.it/23319807-Classificazione-delle-colorazioni.html)

Il reattivo di Schiff

Il reattivo di Schiff Γ¨ composto da fucsina decolorata che, a contatto col DNA per 20-30 minuti, riacquista il colore rosso. Il reattivo puΓ² essere acquistato giΓ  pronto oppure puΓ² essere preparato autonomamente seguendo la ricetta che segue:

  • Sciogliere 0.15 g di fucsina bianca (Figura 3) in 30ml di acqua distillata riscaldata;
  • Lasciar raffreddare e filtrare attraverso carta;
  • Aggiungere 4,5ml di acido cloridrico 1N;
  • Aggiungere 0.45g di potassio metabisolfito e mettere al buio per 24 ore;
  • Una volta filtrata, la soluzione incolore sarΓ  pronta all’uso.
Reattivo di schiff
Figura 3 – Reattivo di Schiff (www.drugdiscoverylab.unina.it)

Procedimento

La reazione di Feulgen consiste in due passaggi principali:

  • Innanzitutto si tratta il materiale per 8-10 minuti con acido cloridrico 1N, in un bagnetto termostatato a 60Β°C;
  • Poi si esegue un lavaggio in HCl 1N freddo, subito dopo poi in acqua distillata;
  • Successivamente, il materiale viene trasferito nel reattivo di Schiff a temperatura ambiente, per almeno 20-30 minuti finchΓ© il tessuto non assume un colore fucsia intenso;
  • Il materiale si puΓ² passare in acetocarmina che reagisce con gli acidi nucleici;
  • In ultimo, si eseguono dei lavaggi in metabisolfito di sodio al 5% e in acqua di fonte.

La lettura al microscopio puΓ² essere eseguita immediatamente; in alternativa il preparato colorato puΓ² essere anche conservato per piΓΉ giorni a 4Β°C.

Come contrasto per il citoplasma si puΓ² utilizzare il verde luce all’1%.

Osservazioni al vetrino

Nelle foto che seguono sono presenti alcuni esempi di vetrini colorati mediante la colorazione di Feulgen.

nuclei colorati con colorazione di Feulgen
Figura 4 – Colorazione del nucleo (www.atlanteistologia.unito.it)

Nell’immagine in Figura 4 sono colorati solo i nuclei delle cellule. In questo caso, non Γ¨ stata fatta alcuna colorazione di contrasto per evidenziare le restanti parti del tessuto.

In Figura 5 e 6, invece, ci sono due esempi di colorazione con contrasto del citoplasma, che Γ¨ di colore verde.

colorazione con contrasto
Figura 5 – Colorazione con contrasto
contrasto con verde, preparazione di fegato di topo
Figura 6 – Colorazione con contrasto, preparazione di fegato di topo (www.istologia.unige.it)

Quantificazione del DNA

Come anticipato, per la quantificazione del DNA mediante la colorazione di Feulgen si utilizzano i principi della densitometria.

La metodica si basa sull’esecuzione di un’idrolisi in acido cloridrico 5M dopo aver fissato il materiale sul vetrino. Subito dopo, si esegue una lettura mediante citofluorimetria a flusso. Il confronto del valore ottenuto con la curva di taratura consente di ottenere una quantificazione rapida del contenuto di DNA nel preparato.

Fonti

  • Greilhuber, J., Baranyi, M., & Greilhuber, J. (1999).Β Feulgen Densitometry: Importance of a Stringent Hydrolysis Regime. Plant Biology, 1(5), 538–540.Β doi:10.1111/j.1438-8677.1999.tb00780.x
  • D.Srinivasachar (1959) Proportionality between nuclear DNA-content and Feulgen dye-content. Experimental Cell Research 17(2), 286-298
  • Benedum, J. and M. Meusch. β€œRobert Feulgen (1884–1955) – some biographical thoughts.” Histochemistry and Cell BiologyΒ 111 (1999): 337-343.

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