Obiettivo della tecnica
La colorazione di Feulgen è una tecnica di istologia utilizzata per evidenziare il DNA su sezioni di tessuto preparate per la microscopia ottica. In condizioni controllate, può essere utilizzata anche per determinare il contenuto di DNA in una preparazione mediante misura densitometrica.
La tecnica prende il nome dal fisiologo tedesco Robert Feulgen (Figura 1) che la mise a punto nel 1925.
Materiale occorrente
Per la colorazione di Feulgen si utilizza l’acido cloridrico e il reattivo di Schiff per colorare il DNA in rosso magenta, mentre non colora l’RNA: La metodica è quindi utile per differenziare il DNA dall’RNA, che sono entrambi basofili.
L’acido cloridrico serve a separare dalla molecola di DNA le basi puriniche. Il deossiribosio libero, in ambiente acido, si trasforma in aldeide e i gruppi aldeidici sono evidenziabili con l’uso del reattivo di Schiff (Figura 2).
L’RNA, invece, non reagisce in quanto la presenza di un gruppo -OH sul carbonio 2 del ribosio impedisce l’idrolisi dello zucchero ad opera dell’acido cloridrico.
Il reattivo di Schiff
Il reattivo di Schiff è composto da fucsina decolorata che, a contatto col DNA per 20-30 minuti, riacquista il colore rosso. Il reattivo può essere acquistato già pronto oppure può essere preparato autonomamente seguendo la ricetta che segue:
- Sciogliere 0.15 g di fucsina bianca (Figura 3) in 30ml di acqua distillata riscaldata;
- Lasciar raffreddare e filtrare attraverso carta;
- Aggiungere 4,5ml di acido cloridrico 1N;
- Aggiungere 0.45g di potassio metabisolfito e mettere al buio per 24 ore;
- Una volta filtrata, la soluzione incolore sarà pronta all’uso.
Procedimento
La reazione di Feulgen consiste in due passaggi principali:
- Innanzitutto si tratta il materiale per 8-10 minuti con acido cloridrico 1N, in un bagnetto termostatato a 60°C;
- Poi si esegue un lavaggio in HCl 1N freddo, subito dopo poi in acqua distillata;
- Successivamente, il materiale viene trasferito nel reattivo di Schiff a temperatura ambiente, per almeno 20-30 minuti finché il tessuto non assume un colore fucsia intenso;
- Il materiale si può passare in acetocarmina che reagisce con gli acidi nucleici;
- In ultimo, si eseguono dei lavaggi in metabisolfito di sodio al 5% e in acqua di fonte.
La lettura al microscopio può essere eseguita immediatamente; in alternativa il preparato colorato può essere anche conservato per più giorni a 4°C.
Come contrasto per il citoplasma si può utilizzare il verde luce all’1%.
Osservazioni al vetrino
Nelle foto che seguono sono presenti alcuni esempi di vetrini colorati mediante la colorazione di Feulgen.
Nell’immagine in Figura 4 sono colorati solo i nuclei delle cellule. In questo caso, non è stata fatta alcuna colorazione di contrasto per evidenziare le restanti parti del tessuto.
In Figura 5 e 6, invece, ci sono due esempi di colorazione con contrasto del citoplasma, che è di colore verde.
Quantificazione del DNA
Come anticipato, per la quantificazione del DNA mediante la colorazione di Feulgen si utilizzano i principi della densitometria.
La metodica si basa sull’esecuzione di un’idrolisi in acido cloridrico 5M dopo aver fissato il materiale sul vetrino. Subito dopo, si esegue una lettura mediante citofluorimetria a flusso. Il confronto del valore ottenuto con la curva di taratura consente di ottenere una quantificazione rapida del contenuto di DNA nel preparato.
Fonti
- Greilhuber, J., Baranyi, M., & Greilhuber, J. (1999). Feulgen Densitometry: Importance of a Stringent Hydrolysis Regime. Plant Biology, 1(5), 538–540. doi:10.1111/j.1438-8677.1999.tb00780.x
- D.Srinivasachar (1959) Proportionality between nuclear DNA-content and Feulgen dye-content. Experimental Cell Research 17(2), 286-298
- Benedum, J. and M. Meusch. “Robert Feulgen (1884–1955) – some biographical thoughts.” Histochemistry and Cell Biology 111 (1999): 337-343.
