Ricerca del DNA tumorale circolante (ctDNA) con la biopsia liquida

I tumori attualmente rappresentano un problema rilevante nel mondo della sanità, perciò molti studi si incentrano sullo studio di tali patologie. Le neoplasie maligne frequentemente sono invasive e metastatizzano in un distretto lontano. Per metastasi si intende la capacità delle cellule tumorali di dislocarsi dall’impianto primitivo, dal quale migrano in una nuova sede secondaria. L’invasività e le metastasi sono un’indice di prognosi infausta, perciò, uno scopo fondamentale della ricerca, riguarda l’esecuzione di diagnosi precoci sensibili e specifiche. Il prelievo del tessuto tumorale tramite biopsia, agoaspirato oppure durante un intervento chirurgico rappresenta il principale metodo per eseguire diagnosi, basato su studi molecolari e di ricerca dei biomarcatori tumorali. Il tessuto prelevato spesso contiene un numero di cellule insufficienti per eseguire i test molecolari. A causa dei vari aspetti negativi, si eseguono procedure meno invasive: la biopsia liquida, attraverso la quale si ricerca il DNA tumorale circolante.

Metodi diagnostici

La diagnosi tempestiva delle neoplasie permette di ottenere una prognosi positiva. Per conseguire tale scopo si applicano dei metodi diagnostici, i quali variano in base all’anamnesi e ai fattori di rischio a cui è sottoposto il paziente. I primi step eseguiti dal personale medico possono essere:

Biomarcatori, i quali possono avere valori più elevati rispetto al range di riferimento, invece in alcuni casi non sono presenti in condizioni fisiologiche e si possono riscontrare nei casi di carcinoma. Un esempio possono essere l’alfa fetoproteina (AFT), l’antigene prostatico specifico (PSA) e anche l’antigene carcinoembrionale (CEA);
Test di imaging come la TAC, la PET, la RX;
Test molecolari, i quali identificano alterazioni cromosomiche attraverso diverse tecniche come la PCR e la FISH;
Esame bioptico o biopsia ossia il prelievo di tessuto istologico attraverso metodi invasivi come l’intervento chirurgico, oppure tecniche meno invasive tra le quali sono comprese le ago biopsie guidate oppure gli esami endoscopici;

Tuttavia, gli approcci appena descritti hanno degli svantaggi in termini di sensibilità e in alcuni casi di specificità diagnostica; in particolare nel primo stadio del cancro non si riscontrano i biomarcatori, inoltre alcuni marker sono rilevabili anche in alcune condizioni fisiologiche (come la gravidanza) oppure in presenza di patologie (ipertrofia prostatica nel caso del PSA). A causa di queste limitazioni, sono stati analizzati nuovi metodi diagnostici: la ricerca del DNA tumorale circolante tramite la biopsia liquida.

La biopsia liquida

La biopsia liquida è un metodo per cui si preleva il tessuto istologico liquido, che può variare in base al sospetto diagnostico. I fluidi corporei prelevati possono essere:

Il sangue;
Il liquido cefalo rachidiano (tumori del sistema nervoso);
L’urina;
La saliva per i tumori testa-collo;

Fluidi prelevati per eseguire biopsia liquida — *Figura 1 – Fluidi prelevati per biopsia liquida [Fonte: Cancer discovery]*

Lo scopo principale della biopsia liquida concerne la ricerca delle cellule tumorali circolanti o del DNA tumorale circolante (ctDNA), poiché i fluidi corporei sono coinvolti nel trasporto del DNA proveniente dalle cellule tumorali. Tale tecnica permette di eseguire diagnosi del tumore primitivo, talvolta la quantità di ctDNA nelle fasi iniziali delle neoplasie è esigua, perciò non viene individuata e il risultato sarà negativo.

Il DNA può essere rilasciato dalle cellule tumorali destinate all’apoptosi o alla necrosi, tuttavia rispetto al DNA derivato dalle cellule sane, la percentuale del ctDNA (derivato da cellule maligne) risulta bassa, specialmente negli stadi iniziali di cancerogenesi, così rappresentando una limitazione nella diagnosi precoce dei tumori.

Il ctDNA è individuabile con la biopsia liquida in dimensioni inferiore ai 167 bp, perciò è stato possibile selezionare unicamente i frammenti di 90-150 bp per facilitarne la ricerca. Il DNA circolante tumorale e le cellule tumorali circolanti (CTC) presentano delle mutazioni comuni con le alterazioni genetiche osservabili nel tumore primario, però il cancro è una patologia eterogenea e a causa di questa caratteristica la cellula può ottenere ulteriori mutazioni, che non vengono riscontrate nel ctDNA. Quest’ultimo può essere analizzato tramite approcci molecolari, attraverso i quali è possibile studiare il profilo genetico del tumore, il quale non indica unicamente le mutazioni, ma anche eventuali resistenze nei confronti degli approcci terapeutici, come la radioterapia e la chemioterapia.

Analisi molecolare del ctDNA

Le tecniche molecolari usate per lo studio del profilo molecolare del ctDNA con biopsia liquida sono diverse e comprendono:

Digital PCR per identificare le mutazioni somatiche nei geni;
Amplificazione e magnetismo o BEA-Ming;
Safe-SeqS;
Profilazione personalizzata del cancro mediante sequenziamento profondo o Capp-Seq;
Sequenziamento profondo dell’amplicone taggato o Tam-Seq;
Next Generation sequencing;
Sequenziamento dell’intero esoma (WES)

Queste tecniche permettono di individuare le mutazioni a singolo nucleotide oppure di eseguire il sequenziamento dell’intero genoma, noto anche come Whole Genome Sequencing (WGS). In conclusione, in base alla metodologia applicata, si possono distinguere due indagini differenti:

L’analisi di varianti già note;
La ricerca di mutazioni de novo;

Next generation DNA sequencing per analizzare il DNA tumorale circolante — *Figura 2 – Next-generation DNA sequencing. [Fonte: https://qph.cf2.quoracdn.net/]*

Digital PCR per l'analisi del ctDNA — *Figura 3 – Digital PCR. [Fonte: https://bimetech.vn/]*

Oltre all’analisi delle mutazioni del DNA, può essere eseguito lo studio delle metilazioni del DNA, il quale ha il vantaggio di ottenere un quadro diagnostico e prognostico.

Possibili applicazioni della ricerca del ctDNA con biopsia liquida

La ricerca del DNA tumorale circolante tramite biopsia liquida può essere impiegato per le diagnosi, come detto in precedenza, ma anche per altri scopi, tra i quali sono compresi:

Stadiazione del tumore, permettendo di distinguere i pazienti a basso ed alto rischio;
Prognosi del paziente;
La metastatizzazione;
La resistenza alla terapia tumorale (chemio e radioterapia);
Possibili recidive;

L’analisi del ctDNA con lo scopo di valutare il percorso terapeutico dei pazienti, può avere tre esiti:

Riduzione del ctDNA che indica che la terapia sta funzionando;
Aumento del ctDNA o valore invariato denota che la terapia non ha effetto;
Riduzione iniziale del ctDNA e aumento dopo un certo lasso di tempo, determina che il tumore è recidivante;

Perciò, la ricerca del DNA con biopsia liquida è una nuova tecnologia che può essere impiegata nello studio personalizzato dei tumori sfruttando vari metodi, che vengono scelti in base allo scopo dell’analisi. Con la ricerca, stanno emergendo nuovi metodi, tra i quali sono compresi: l’analisi del micro-RNA privo di cellule e anche l’RNA tumorale circolante. In conclusione, la biopsia liquida rappresenta una nuova tecnologia per affrontare l’oncologia.

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