Tecnica FISH: principio dell’ibridizzazione in situ con sonde fluorescenti

Per poter capire a fondo quali siano i principi di cui si avvale la tecnica FISH, è importante precisare cosa sia l’analisi citogenetica. Lo studio citogenetico, infatti, si pone come obbiettivo l’analisi dei cromosomi delle cellule al fine di determinare eventuali alterazioni del numero e/o della struttura degli stessi, che possono essere responsabili di varie malattie (es. Sindrome di Down). L’analisi citogenetica è detta anche esame del cariotipo o mappa cromosomica.

In alcuni casi la sola tecnica di citogenetica tradizionale, che consiste nello studio microscopico dei 23 cromosomi umani (permettendo una valutazione della ploidia cellulare e l’eventuale identificazione di aberrazioni cromosomiche ricorrenti), non è sufficiente perché è legata ai limiti della lettura al microscopio ottico. Lo sviluppo della citogenetica molecolare, con tecniche come la FISH, ha permesso di identificare i riarrangiamenti submicroscopici e rilevare piccolissime trisomie o microdelezioni parziali.

Principio della tecnica FISH

La FISH (Fluorescence In Situ Hybridazation) è una tecnologia che utilizza sonde nucleotidiche marcate, note come DNA probes, per identificare specifiche regioni di un cromosoma, ovvero determinate sequenze di DNA. Le sonde utilizzate possono consistere in genomi completi, segmenti cromosomici, qualsivoglia segmento genomico clonato in cosmidi, sequenze di DNA altamente ripetuto (ad esempio le telomeriche), o semplici sequenze nucleotidiche. Come tecnica citogenetica, la FISH può essere utilizzata su metafasi o nuclei in interfase provenienti da diverso materiale biologico, come ad esempio il sangue, biopsie o liquido amniotico.

risultato tecnica FISH
Figura 1 – Possibile risultato della tecnica FISH
tipi di sonda nella tecnica FISH
Figura 2 – Schema riassuntivo dei tipi di sonda utilizzabili nella tecnica FISH

Metodo

La FISH è una tecnica usata per la costruzione di mappe fisiche, ovvero identifica la posizione sui cromosomi di determinate sequenze. Ciò è permesso dall’utilizzo di sonde marcate con fluorescenza e, infine, il risultato viene osservato al microscopio a fluorescenza.

Questa tecnica si basa sulla proprietà del DNA di denaturarsi in modo reversibile (apertura della doppia elica) e prevede il legame tra un frammento di DNA specifico per la regione di interesse e la sequenza di DNA complementare del preparato, che è stato fissato e montato su un vetrino portaoggetti: la regione cromosomica di interesse risulta così facilmente individuabile. Ripercorriamo i vari step grazie la Figura 3:

tappe della metodica
Figura 3 – Tappe della metodica

Negli ultimi anni si è cercato di migliorare sempre di più la tecnica, un importante esempio è la “Multicolor-FISH” (M-FISH). Si tratta di un’altra metodica di ibridizzazione fluorescente che fa uso di una serie di sonde in grado di “colorare” in maniera specifica ogni singolo cromosoma. L’effetto multicolore ottenibile con M-FISH è dato dall’utilizzo di fluorocromi diversi che così identificano anomalie di cariotipi complessi.

Applicazioni della FISH

L’utilizzo di sonde specifiche dato dalla tecnica FISH vede un largo impiego per la diagnosi rapida di anomalie cromosomiche. Un possibile esempio di applicazione risiede nella diagnosi prenatale: di fatto la FISH su cellule di liquido amniotico non coltivato, permette l’utilizzo di sonde specifiche per i cromosomi 13, 18, 21, X e Y.

Generalmente, questa analisi viene eseguita qualora, dopo il riscontro di anomalie strutturali del feto in ecografia del secondo trimestre, si ritenga necessaria una diagnostica d’urgenza. In determinate circostanze può avere un’applicazione facoltativa, soprattutto nel caso in cui uno screening preliminare evidenzi un rischio aumentato di anomalia cromosomica. Una volta che lo stato di ploidia dei 5 cromosomi indagati si dimostra essere normale, il rischio per le rimanenti anomalie cromosomiche è significativamente ridotto.

La FISH rappresenta un indispensabile complemento della citogenetica molecolare che negli ultimi anni vede un’importante applicazione in campo oncologico. In molti casi, specialmente per le colture di tumori solidi, non si ottiene crescita e divisione cellulare quindi non si possono evidenziare i cromosomi ed analizzarli. In tal senso, la FISH ha un’elevato potere predittivo: è capace di identificare anomalie cromosomiche tipiche del tumore prima che ci sia evidenzi malattia o positività di altri marcatori diagnostici quali le CTM (cellule tumorali maligne).

Un possibile esempio è rappresentato da quei pazienti che hanno una FISH positiva per l’amplificazione di un gene chiamato HER2: quest’ultimo è un recettore trans membrana ad attività tirosinchinasica la cui attivazione innesca una cascata di proteine che determinano effetti biologici quali l’attivazione dell’angiogenesi, alterazioni del controllo del ciclo cellulare, inibizione dell’apoptosi ed aumentata proliferazione e sopravvivenza cellulare.

HER2 è amplificato o sovra espresso nel 25-30% dei tumori mammari e si associa ad una prognosi nettamente peggiore dell’adenocarcinoma gastrico (ACG), il quale rappresenta la seconda e la quarta causa di morte per cancro nel mondo rispettivamente nel sesso maschile e femminile.

Vantaggi e limiti della tecnica

La tecnica FISH presenta diversi vantaggi come anche delle limitazioni.

Vantaggi:

  • Esamina un elevato numero di cellule in tempi brevi;
  • Elevata efficienza di ibridizzazione;
  • Elevata sensibilità e specificità;

Limiti:

  • Informazioni limitate al singolo gene/cromosoma (se si fa riferimento alla classica FISH);
  • Esame simultaneo di pochi DNA bersaglio;
  • Le percentuali di errore dovute a falsi positivi e/o falsi negativi posso raggiungere valori relativamente elevati (~7%);

Inoltre bisogna tener conto del problema del mosaicismo, a causa del quale è possibile che cellule provenienti dallo stesso embrione presentino un differente cariotipo. Può accadere, quindi, che la cellula analizzata risulti normale all’analisi citogenetica mentre altre cellule dello stesso embrione presentano alterazioni cromosomiche, o viceversa. Tale fenomeno è relativamente frequente e può condurre ad errori di diagnosi.

Fonti

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