Microscopio a fluorescenza: cos'è e come funziona

Che cos’è la fluorescenza?

La fluorescenza è un fenomeno fisico, in cui una sostanza si eccita assorbendo determinate radiazioni elettromagnetiche di una certa lunghezza d’onda e li riemette ad una lunghezza diversa o superiore a quella assorbita. L’eccitazione degli atomi del fluoroforo promuove gli elettroni ad un nuovo livello energetico dove perdurano solo per un determinato periodo di tempo dopodiché l’elettrone eccitato torna al suo stato fondamentale. Quando ritorna al suo stato fondamentale si ha il rilascio di un fotone in un tempo di nanosecondi nello spettro del visibile.

Di seguito è possibile approfondire l’argomento della fluorescenza con un video di Marco Coletti del canale “La fisica che non ti aspetti“.

Video di Marco Coletti che tratta il fenomeno della fluorescenza e fosforescenza.

Com’è fatto un microscopio a fluorescenza?

Il microscopio a fluorescenza più utilizzati sono quelli ad epifluorescenza caratterizzati da un’illuminazione dall’alto. Questo è composto da (Figura 1):

*Figura 1- Immagine dello schema di un microscopio a epifluorescenza e del percorso ottico.*

1) Sorgente: Costituisce la sorgente di luce necessaria per l’illuminazione del campione. Questa deve fornire molta energia di eccitazione in una regione molto ristretta dello spettro – tipicamente da 100 a 500 nm. Tra queste ricordiamo: lampade a vapori di mercurio (Figura 2), lampade allo xeno ad arco e laser.
2) Filtro antitermico
3) Filtro d’attenuazione del rosso
4) Diaframma di campo
5) Filtro di eccitazione: Seleziona una determinata lunghezza d’onda per il fluorocromo che si è utilizzato
6) Partitore dicorico: Riflette la luce e la indirizza sul preparato
7) Obiettivo: Raccoglie l’emissione prodotta, che presenta una lunghezza d’onda maggiore della luce d’eccitazione
8) Campione
9) Filtro di sbarramento: Elimina l’eventuale residua luce d’eccitazione lasciando passare quella emessa per fluorescenza
10) Lente intermedia
11) Oculare

*Figura 2 – Lampada a vapori di mercurio, sorgente di luce del microscopio a fluorescenza.*

Microscopio a ipofluorescenza

Molto simile a quello appena visto, è il microscopio a fluorescenza con illuminazione del campione dal basso o ipofluorescenza. Il percorso ottico, in questo caso, è quello consueto per un microscopio ottico in luce trasmessa, con la lampada in basso e la luce focalizzata sul campione attraverso il condensatore.

Mentre nel microscopio ad epifluorescenza, infatti, la luce di eccitazione colpisce il campione dall’alto, andando a finire al di sotto del tavolino, in quello ad ipofluorescenza la luce attraversa il campione dal basso verso l’alto e penetra nell’obiettivo assieme alla fioca luce emessa per fluorescenza dal campione (Figura 3). Tuttavia oggi è poco utilizzato perché errate manovre o filtri di sbarramento inadeguati possono provocare seri danni agli occhi dell’osservatore.

Microscopio confocale

Quando i campioni fluorescenti sono osservati con un microscopio
convenzionale, la fluorescenza secondaria delle zone più lontane dal punto di osservazione spesso interferiscono con le parti che sono focalizzate.
Questo problema è tanto più grande nel caso in cui il campione in esame
abbia uno spessore di più di 2 mm.
La soluzione a questo problema è la microscopia confocale in cui si registra
solo l’immagine che è messa a fuoco eliminando tutto il resto.

Come funziona il microscopio a fluorescenza?

La luce viaggia dalla forte sorgente di luce (Figura 4) attraverso alcuni filtri (antitermico e di attenuazione del rosso) ed il diaframma di campo fino al filtro di eccitazione che seleziona un intervallo di lunghezze d’onda specifico per il fluorocromo da utilizzare.

Video che mostra il percorso ottico del microscopio a fluorescenza.

Il partitore dicroico riflette la luce d’eccitazione indirizzandola sul preparato attraverso l’obiettivo. L’emissione prodotta, che presenta una lunghezza d’onda maggiore della luce d’eccitazione, viene raccolta dall’obiettivo e trasmessa attraverso il partitore dicroico.

*Figura 4 – Percorso ottico semplificato del microscopio a fluorescenza*

Poi i raggi passano anche attraverso il filtro di sbarramento che elimina la eventuale, residua, luce di eccitazione, lasciando passare quella emessa per fluorescenza. La lente del tubo e l’oculare formano come d’uso l’immagine microscopica, che si compone, ora, solamente di luce prodotta dalla fluorescenza.

Il filtro di sbarramento, al di sopra dell’obiettivo, consente l’eliminazione della luce di eccitazione dal percorso ottico, preservando gli occhi dell’osservatore dai raggi UV e consentendo alla luce emessa per fluorescenza di brillare su un fondo divenuto scuro.

Osservare al microscopio

L’osservazione al microscopio permette di evidenziare con certezza alcune strutture o cellule in modo specifico. Inoltre aiuta a evidenziare specifici processi cellulari o fasi di questi. I campioni sottoposti ad osservazione possono essere dotati di fluorescenza intrinseca, in questo caso parliamo di autofluorescenza o indotta tramite l’uso di sostanze dette fluorocromi.

Diverse sono i modi in cui i campioni possono essere dotati di fluorescenza. Tra questi ricordiamo:

Proteine fluorescenti

Quelle più conosciute sono le seguenti:

GFP, green fluorescent protein, espressa nella medusa Aequorea victoria, è stata utilizzata negli ultimi decenni per esperimenti e tecniche di biologia molecolare. La GFP, se colpita e eccitata da una specifica lunghezza d’onda, ne rimette luce di un colore acceso. Sono ormai molte comunque le forme di GFP modificate, in grado di assorbire e emettere radiazione diverse da quelle della proteina originaria (Figura 5).

*Figura 5 – A sinistra la medusa Aequorea victoria dalla quale è stata estratta la green fluorescent protein. A destra cellule simili a fibroblasti del rene coltivate in coltura e marcate con GFP.*

YFP, yellow flourescent protein, è una variante della GFP, il suo picco di eccitazione è 514 nm e il suo picco di emissione è 527 nm. YFP rappresenta un utile strumento per la biologia cellulare e molecolare grazie alle sue proprietà utili per la microscopia a fluorescenza (Figura 6).

Neuroni dell'ippocampo, marcati con YFP, yellow fluorescent protein — *Figura 6 – Neuroni dell’ippocampo, marcati con YFP, yellow fluorescent protein*

BFP, blue fluoescent protein
RFP, red fluorescent protein

Tra gli altri composti utilizzati per rendere fluorescente un campione possono essere utilizzati molecole che possono donare una tipica colorazione al campione, tra questi le principali sono la:

Colorazione con arancio di acridina (Figura 7)

colorazione con arancio di acridina diverso comportamento cellule umane e microrganismi — Figura 7 – La colorazione con arancio di acridina è una metodica utilizzata nella microscopia in fluorescenza. Essa permette l’osservazione di una vasta gamma di microrganismi e cellule diverse, dal momento che il colorante ha come target gli acidi nucleici e presenta inoltre un comportamento fluorescente differente tra DNA e RNA.

Colorazione con auramina (Figura 8)

Colorazione con Auramina: i micobatteri sembrano piccoli frammenti d’oro su uno sfondo totalmente nero. Colorazione usta nella microscopia a fluorescenza. — *Figura 8 – Colorazione con Auramina: i micobatteri sembrano piccoli frammenti d’oro su uno sfondo totalmente nero.*

Colorazione con Honest

Immunofluorescenza

Agli inizi della microscopia in fluorescenza, i preparati venivano colorati
per lo più con fluorocromi non specifici, che si comportavano come generici
coloranti. Questo tipo di marcatura risulta generalmente luminoso, dato che i legami delle numerose molecole fluorescenti avvengono ovunque. Oggi, i metodi di marcatura sono diventati molto più specifici. Ciò si è ottenuto accoppiando permanentemente sostanze biologiche, come gli anticorpi, ai fluorocromi. Allora non è più il fluorocromo a decidere dove legarsi ma la molecola biologicamente attiva (sonda) che “cerca” e si lega specificamente al suo antigene (target). Normalmente, ciò conduce ad immagini
con fluorescenza più debole perché viene legato molto meno “colorante” (Figura 9).

L’immunofluorescenza si avvale dell’utilizzo di anticorpi marcati con una sostanza fluorescente ed è molto utilizzato per la preparazione di sezioni istologiche. Si può avvalere di metodo diretto, ossia una sostanza fluorescente legata direttamente all’anticorpo.

Figura 9 – Embrione di alligatore nella fase di sviluppo dei nervi e dello scheletro.
Tecnica: immunofluorescenza, ingrandimento 10x. Autori: Daniel Smith Paredes e Bhart-Anjan S. Bhullar

Il metodo indiretto invece consiste nell’utilizzo di due anticorpi, il primo riconosce l’antigene cercato, il secondo riconosce il primo anticorpo che ha legato il target.