Centrifuga da laboratorio, l'indispensabile tecnica di separazione

Apparecchiatura di laboratorio utilizzata per studiare il comportamento delle particelle messe in un campo gravitazionale artificiale; cosicché sottoposte a Forza Centrifuga, tendono a migrare verso il basso. La centrifuga da laboratorio è quindi un mezzo di separazione e precipitazione.

Caratteristiche generali

La centrifuga da laboratorio è una macchina in cui è presente un rotore collegato ad un asse verticale centrale dello strumento. Il rotore gira ad una velocità variabile e per un tempo programmabile; ed è quella parte della centrifuga che incorpora in un suo alloggiamento, le provette che contengono i soluti da separare. La separazione dipende dalla velocità e dal tempo impiegato, ma anche dalla Forza Centrifuga applicata, le dimensioni delle particelle e dal tipo di solvente utilizzato.

Figura 1 - Sezione di rotore
[Fonte: https://slideplayer.it/slide/526755/] — Figura 1 – Sezione di rotore della
centrifuga da laboratorio
[fonte: https://slideplayer.it/slide/526755/]

Alcune formule per la centrifuga da laboratorio

Partiamo dal presupposto che la forza della centrifuga da laboratorio, cioè quella agente sulle particella per la loro sedimentazione, è espressa attraverso il parametro RCF: Forza Centrifuga Relativa. La RCF mette in relazione da FC (forza centrifuga) e la FG (forza di gravità), infatti esprime quante volte la FC (con rotazioni al minuto, rpm) supera la FG.

*Figura 2 – Forza Centrifuga Relativa RCF che esprime la forza agente sulla particella in un campo centrifugo*

Successivamente alla procedura di centrifuga da laboratorio, per facilitare la risoluzione dell’equazione precedente ed evitare calcoli, ci affidiamo alla rappresentazione grafica di un normogramma. Se infatti vogliamo centrifugare un campione ad un determinato valore di RCF, dobbiamo modificare la velocità di centrifugazione agendo sui rpm. In sintesi per conoscere il valore di RCF devo calcolare gli rpm e risolvere in questo modo l’equazione.

In una condizione di equilibrio del sistema delle centrifuga da laboratorio, le particelle sottoposte a centrifuga, si muovono e accelerano fino a quando la loro Forza di Sedimentazione che le spinge a raggiungere il fondo, non si uguaglia alla loro capacità di generare attrito durante l’accelerazione. Questa capacità è la Forza di Attrito che si oppone allo spostamento delle particelle. Ma una volta raggiunto l’equilibrio, queste due forze si uguagliano e le particelle non accelerano più perché hanno raggiunto la loro massima velocità che le porta a sedimentare. Da qui è possibile calcolare la velocità di sedimentazione delle particelle.

Velocità di sedimentazione, proporzionale alle dimensioni della particella, alla differenza di densità, al campo centrifugo e inversamente alla viscosità — *Figura 3 – velocità di sedimentazione*

Specifichiamo che la velocità di sedimentazione è proporzionale a:

dimensioni della particella;
differenza di densità della particella e densità del mezzo;
campo centrifugo.

Aggiungiamo che la velocità di sedimentazione è inversamente proporzionale a Teta o coefficiente di viscosità del mezzo.

Svedberg, velocità di sedimentazione

La velocità di sedimentazione può anche essere espressa come coefficiente di sedimentazione S, quando il campo generato dalla forza centrifuga è unitario cioè uguale ad 1. Il simbolo S indica l’unità di misura della velocità e si riferisce a Svedberg; la velocità così rappresentata si misura in condizioni standard (20°C in acqua). Quindi il suo valore dipende dalla temperatura e dalla viscosità del mezzo, ragion per cui viene valutata in queste condizioni. Svedberg si usa quando non si riesce a misurare le dimensioni delle particelle espresse in peso molecolare.

Centrifuga differenziale

La tipologia oggi usata in laboratorio è quella di tipo preparativo, che consente separazione, isolamento con purificazione di cellule, membrane plasmatiche, acidi nucleici, lipoproteine. Un esempio di questo tipo di centrifuga da laboratorio è la tipologia differenziale o frazionata che si basa sulle diverse velocità di sedimentazione delle particelle. Al termine di questa centrifuga, infatti, dimostreremo che sedimentano per prime le particelle più grandi e quelle di maggiore densità. Questa centrifuga si usa in laboratorio per la raccolta di cellule e per la produzione di frazioni cellulari a partire da un lisato cellulare o un tessuto omogeneo.

Supponiamo di lavorare su un omogenato cellulare rappresentato da fegato tagliuzzato. La centrifuga viene impostata a densità e viscosità costanti e serve sia per la separazione di ac. nucleici che per i diversi componenti cellulari. Inizialmente l’omogenato è in una provetta e viene sottoposto ad una prima centrifuga a bassa velocità (RCF = 900). Con il normogramma possiamo impostare una velocità di rotazione (2.500 rpm) che varia a seconda del raggio del rotore. Mentre all’inizio le particelle sono distribuite uniformemente nella provetta, al termine di questa prima centrifuga otterremo un precipitato (pellet) contenente intere cellule, nuclei, membrane plasmatiche; e una parte solubile (sopranatante). Ogni ciclo si separano le due fasi. Sottoponiamo il sopranatante ad una ulteriore centrifugazione a velocità maggiori e quindi aumentiamo la RCF. Nuovamente otteniamo le due fasi ben separate. Si procede in questa modalità e ci fermiamo in base alle particelle ottenute che saranno oggetto di studio.

Centrifugazione isopicnica

Tecnica all’equilibrio in gradiente di densità che permette la separazione delle particelle sulla base della loro densità. Il gradiente può essere stratificato su un gradiente preformato che deve coprire l’intervallo di densità delle particelle da separare. Tecnica indipendente dal tempo, mostra come la distribuzione delle particelle corrisponde alla loro rispettiva densità e una volta raggiunto l’equilibrio non viene alterato dal tempo di centrifugazione.

Con questa tecnica le particelle non si posizionano mai sul fondo, ma galleggiano cioè si muovono fino a quando la loro densità sarà uguale a quella del mezzo circostante e allora si fermano nel loro punto isopicnico. Questo è il punto all’equilibrio.

Applicazioni della centrifuga da laboratorio isopicnica

La prima applicazione che riportiamo è la separazione mediante tecnica di centrifugazione isopicnica. Questo metodo è stato utilizzato da Meselson e Stahl durante i loro esperimenti per chiarire il meccanismo di replicazione del DNA. Le analisi delle aliquote di questo esperimento vengono analizzate con centrifugazione a gradiente continuo di saccarosio, che gradualmente separa le molecole sulla base del PM (peso molecolare) e quindi per velocità di sedimentazione. L’uso della centrifuga da laboratorio serve, in questo caso specifico, a dimostrare che la replicazione del DNA genomico è di tipo semiconservativo.

Un’altra applicazione importante della centrifuga da laboratorio, di tipo all’equilibrio, è la centrifugazione in CsCl+Etidio bromuro. Questo metodo, a differenza del precedente, è stato usato per lo studio sulla topologia del DNA perché permette di discriminare tra molecole circolari rilassate o lineari, lavorando a concentrazioni saturanti di Etidio Bromuro. Il DNA nella sua topologia più compatta avrà infatti densità maggiore rispetto alla densità dello stesso nella sua topologia aperta o lineare.